1、从精准医学看结直肠癌诊断与治疗的未来 上海交通大学医学院附属第九人民医院普外科顾岩摘要我国的结直肠癌已经进入高发期。2015年是精准医学计划的启动之年。结直肠癌的精准医学就是在癌症基因组测序和信息分析基础上，解析结直肠癌发生、发展、侵袭、转移和复发的机制，有针对性地实施个体化治疗。由全球多个国家的专家组建的结直肠癌分型团队，整合以往以基因检测为基础的结直肠癌亚型分类系统，参考基因突变、拷贝数、甲基化、microRNA和蛋白质组学信息，建立了4个各具特征的共识分子亚型（CMSs）。其清晰的生物判读性，成为目前最有力的结直肠癌分类系统，并有望为建立临床精准治疗体系提供参考依据。结直肠癌是人类最常见
2、的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率分别居于癌症谱的第3和第4位。结直肠癌5年总生存率约为60%。其生存率与肿瘤TNM分期明显相关，、和期患者的5年生存率分别约为90%、70和10%。目前，我国的结直肠癌已经进入高发期。2015年全国肿瘤登记中心年报信息显示，结直肠癌的发病率和病死率分别位居癌症谱的第3和第5位。北京市卫计委2015年北京市健康白皮书报告，北京市户籍居民的男性与女性结直肠癌发病率分别高居癌症谱的第2和第3位，发病率均超过30/10万年。因此，提高结直肠癌的早期诊断水平，有针对性地实施个体化治疗的策略备受关注。一、精准医学的概念2015年1月20日，美国总统奥巴马在国情咨文中提出精准
3、医学（precision medicine）计划。精准医学是在充分考虑个体间差异的前提下，针对个体或者特定人群开展的疾病诊断、治疗及预防等医学新模式。换言之，是在适宜时间、为适宜患者、提供适宜的治疗。伴随人类基因谱解码，基因组测序技术迅猛发展，转录组、蛋白质组和代谢组也产生了海量的数据，借助大数据分析的工具，生成具有个体化诊断和治疗指导价值的生物医学信息，将成为精准医学计划得以实施的基石。从本质上讲，精准医学是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术，对于大样本人群和特定疾病类型进行生物标记物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确
4、亚分类，最终实现对于疾病和特定患者进行个体化精确治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益。奥巴马的精准医学计划设定了4个要素： （1）恰当的治疗（the right treatment）：其核心在于为恰当的人群提供精准的诊断信息；（2）恰当的时间（at the right time）：所有的医疗只有在恰当的时间节点给予，才是真正合适的；（3）分享和参与（give all of us access）：政府机构、医疗机构及患者对精准医学的支持和参与，并共同分享信息；（4）个体化信息（personalized information）：精准医学是因人和因病而异的更加精确的个体化医疗，是个体化医疗的最高境
5、界。即便同种类型的疾病，在分子层面上的分型也会千差万别。因此，每例患者都是独一无二的，其预防、诊断和治疗信息都应该个体化。二、癌症的精准医学计划在美国已开始的癌症基因组研究计划（The Cancer Genome Altas，TCGA）基础上，进一步筛选和鉴定驱动基因突变，以期实现在癌症诊治方面的突破。借助癌症基因组测序和信息分析，阐明癌症基因组的异质性特征，解析癌症发生、发展、侵袭、转移和复发的机制，解释癌症药物抗性的原因，建立癌症联合用药的新指南，最终形成对癌症的预防发生、分子分型、精确诊断、治疗反应预测等一整套精准医学指标。1癌症分子标志物筛选和精确分型：TCGA计划已筛选和鉴定出多种与
6、癌症发生、发展、侵袭、转移等生物学行为有关的关键基因，继而将利用大样本量的临床研究验证在癌症诊断、治疗或预后判断中的敏感性和特异性，从而建立起全新的癌症精准分类模式。2癌症精准预防：在癌症的有效治疗手段相对有限的情况下，癌症预防的意义更为重大。利用TCGA计划筛选的癌症基因和大样本量的临床验证，鉴定出有效的癌症发生关键基因，从而在早期对癌症高危人群进行筛查，并制定个体化的预防措施。3癌症精准治疗：精准治疗是癌症精准医学的重点。主要涉及两方面的内容，传统化学和放射治疗的精准化，以及基于分子和基因靶向的精准治疗。借助癌症基因组计划，筛选传统放化疗敏感基因和抵抗基因，在提高疗效的同时降低治疗不良反应
7、；癌症靶向治疗是根据癌症发生所涉及的异常分子和基因，设计针对特定分子和基因靶点的药物，高选择性地杀伤肿瘤细胞。已经上市的靶向药物主要有特定的受体抑制剂（如表皮生长因子受体阻断剂吉非替尼）、某些特定细胞标志物的单克隆抗体（如HER-2单克隆抗体赫赛汀）、酶和酶受体抑制剂（如酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼）、抗肿瘤血管生成药物（如抗血管内皮生长因子单克隆抗体贝伐珠单抗）等。免疫治疗是癌症精准医学的另外一个重要方向。正常情况下，癌细胞中的基因错义突变产生的突变蛋白质，可作为一种肿瘤新抗原被机体免疫系统识别，启动T细胞免疫实现有效杀伤，是机体抑制癌症发生的自我保护机制。如果免疫机制弱化或者消失，就造成癌细胞
8、无法被及时清除，并引发癌症。利用癌症新抗原增强机体T细胞免疫的策略，在癌症治疗中具有重要意义。最近，美国FDA已经分别批准针对PD-l的单克隆抗体Pembrolizumab和Nivoluma用于治疗晚期、无法手术切除且对药物治疗无效的黑色素瘤和肺鳞癌的二线治疗。2015年6月1日美国临床肿瘤学会（ASCO）年会宣布两项临床研究计划：ASCO的TAPUR研究（Targeted Agent and Profiling Utilization Registry）和美国国家癌症研究所（NCI）的NCI-MATCH研究（Molecular Analysis for Therapy Choice tria
9、l）均于2015年底前开始招募患者。TAPUR是一项前瞻性、非随机的临床研究，其计划采集信息以评价目前已经上市的靶向药物对于存在基因突变靶点的肿瘤（包括晚期实体肿瘤、多发性骨髓瘤和B细胞非霍奇金淋巴瘤）的有效性和毒性。NCI-MATCH研究计划收集3000例患者肿瘤活检样本并进行DNA测序，以确定遗传变异，继而筛选出药物靶点，有靶点的样本将用来完成后续的临床试验。这些研究将给携带特定基因突变的癌症患者带来靶向治疗的新希望。三、结直肠癌的精准医学基于原发肿瘤的解剖学位置、肿瘤大体形态、病理学分化程度和癌症TNM分期，结直肠癌可以被分为多种类型、级别或者期别。但是，基于解剖学、组织病理学等宏观和亚
10、微观指标进行的传统结直肠癌分类方法，正遭遇到来自MSI、 MMR、EGFR、KRAS、NRAS和BRAF等基因标志物微观分子检测手段的严峻挑战。结直肠癌的发生发展是多基因、多分子、多通路间错综复杂、相互作用的结果，在基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学的背景下，结直肠癌精准分子分型已经初见端倪，并被用于结直肠癌的精准诊断和治疗，甚至预测远期效果。（一）结直肠癌相关分子检测及意义1错配修复（mismatch repair，MMR）状态：MMR基因可修正DNA复制过程中出现的错误，以保证DNA复制的准确性。其主要包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等基因。MMR基因功能缺陷常导致微卫星体（
11、microsatellite，MS）的长度发生变化，称微卫星体不稳定（microsatellite instability，MSI）。约15结直肠癌的发生与MMR基因功能缺陷有关。肿瘤DNA可检出高频度的MSI （MSI-H），其中约12为MLH1基因启动子甲基化所致的散发性MSI-H肿瘤，约3见于MMR胚系突变所致的Lynch综合征患者。临床MSI-H肿瘤具有右半结肠多见、组织学类型以伴黏液腺癌或低分化腺癌多见等特点。另外，MSI-H肿瘤对以氟尿嘧啶（5-FU）为主的化疗不敏感，但预后好于微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）的肿瘤。因此，NCCN结直肠癌临床实践指
12、南建议：（1）所有期肿瘤患者应进行MMR状态检测，以指导治疗和提示预后；（2）年龄70岁或 70岁但符合Bethesda指南的患者，应检测肿瘤MMR状态以排除Lynch综合征。需要强调的是，为提高Lynch综合征的检出率，越来越多的机构对初诊结直肠癌患者进行MMR状态筛查。2KRAS/NRAS基因突变检测：虽然大多数结直肠癌均可检出EGFR高表达，但EGFR基因在结直肠癌中的突变率仅有1%2%，研究显示，EGFR状态并不能预测抗EGFR单克隆抗体的靶向治疗反应。RAS/RAF/MAPK通路位于EGFR下游，RAS突变后无需EGFR接受信号即可自动活化该通路，引起细胞增殖。因此，只有RAS基因野
13、生型患者才对EGFR单抗治疗有效。KRAS基因在结直肠癌中突变率约为40%。NRAS突变率约4%。2015年版NCCN结直肠癌临床实践指南建议对所有转移性结直肠癌进行KRAS和NRAS突变检测。有突变者不宜采用抗EGFR靶向治疗。3BRAF基因突变检测：BRAF在结直肠癌中的突变率为5%15，在MSI-H肿瘤中突变率明显高于MSS肿瘤。BRAF突变与KRAS突变通常为互斥的。NCCN指南建议，对KRAS/NRAS野生型的期患者可选择BRAF突变检测。尽管BRAF基因状态对EGFR单抗的预测作用尚存在争议，但多数研究认为BRAF突变提示预后不良。此外，由于BRAF-V600E突变仅见于MLH1启
14、动子甲基化所致的MSI-H肿瘤中，故该检测还可用于区分散发性和Lynch综合征相关性MSI-H肿瘤。4其他分子检测指标：虽然RAS基因野生型患者可选择抗EGFR靶向治疗，但仍有近半数的患者对治疗无反应，研究者在继续寻找其他疗效预测标记。PIK3CA为PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）的催化亚基，参与PI3K/PTEN/Akt/mTOR信号通路的调控，是EGFR的下游信号分子，在结直肠癌患者中的突变率为15%20%。研究显示，PIK3CA基因突变型结直肠癌患者预后较差，且对EGFR单抗治疗不敏感。因此，PI3KCA基因突变检测在提示结直肠癌患者预后和指导治疗方面的意义备受关注。该通路中另一重要基因
15、PTEN在结直肠癌中的缺失发生率达15%20%，也被认为可能对EFGR单抗的疗效有预测作用。二磷酸尿苷葡萄糖醛酸转移酶（uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT1A1）参与伊立替康在体内的代谢，但UGT1A1基因的多态性可导致部分患者对伊立替康的灭活能力降低，造成药物在体内的蓄积和不良反应。UGT1A1*28(7/7）基因型患者需降低伊立替康用量。因此，用药前可对患者的UGT1A1*28多态性进行检测。（二）结直肠癌症的分子标志物筛选和分子分型2012年，TCGA计划项目在Nature杂志发布了人类结直肠癌的综合分子标志物特征。201220
16、14年相继出现了6个相互独立、基于基因表达的结直肠癌亚型分类系统。6个分类系统间有共性，但是，相互间在亚型数量和释义方面的不一致也显而易见。为解决分类系统间的冲突并促进临床转化，来自全球多个国家的专家组建了结直肠癌分型团队，整合基因突变、拷贝数、甲基化、microRNA和蛋白质组学信息，以评估基于基因表达的结直肠癌分型中的核心亚型。专家团将纳入分型的4151例患者的癌症基因组信息，采用集成网络化分析模式，将上述具有关联性的6个独立分类系统合并为4个各具特征的共识分子亚型（consensus molecular subtype，CMS）：（1）CMS1型（微卫星不稳定的免疫型，占14%），表现为
17、高突变性，微卫星不稳定及免疫高度活化；（2）CMS2型（经典型，占37%），表现为上皮细胞分化，WNT和MYC信号通路显著激活；（3）CMS3型（代谢型，占13%），表现为上皮细胞分化，明显的代谢失调；（4）CMS4型（间质型，占23%），表现为转化生长因子TGF-显著激活，间质浸润和血管新生。目前，CMS分型是最有力的结直肠癌分类系统，具有清楚的生物判读性，可能成为未来临床分层和基于分型的靶向干预的基础。关于基因组异常，CMS1型表现高突变性和低频体细胞拷贝数改变（somatic copy number alterations，SCNAs）。CMS1型包含大部分MSI肿瘤，反向蛋白芯片（RP
18、PA）分析证实其过表达参与DNA损伤修复的蛋白，符合DNA错配修复缺陷。正如预期，分析TCGA甲基化谱显示CMS1肿瘤表现为广泛高甲基化状态。相反地，测量SCNAs数目可以显示CMS2型和CMS4型的染色体不稳定性（CIN）更高。相对于其他类型，在CMS2型肿瘤中检测到原癌基因拷贝数更高及抑癌基因拷贝数缺失。特别指出，CMS3型在全基因组和表观遗传模式上与其他CIN肿瘤不同：（1）SCNAs始终更少，这种关系无法用肿瘤纯度差异解释；（2）近30样本高突变，这与MSI状态重叠；（3) CpG岛甲基化表型（CIMP）频发在TCGA样本中低群集，基因甲基化水平中等。关于基因突变，虽然CMS1型高发B
19、RAF突变（符合已知的与MSI肿瘤相关）及CMS3型高发KRAS突变，但是，没有任何一种亚型被一项单独的基因突变所定义，也没有任何一种基因突变被限定在一种亚型内。与之类似，虽然CMS2型富含编码转录因子HNF4A基因拷贝，却未发现SCNA与某一种亚型有密切关系。由于单基因突变无法清晰地描述CMS的组别，专家组试图用TCGA数据综合分析突变和拷贝数改变以寻找可能突出不同亚型生物学特性的信号转导通路。然而，除了发现CMS1和CMS3中几乎普遍存在的受体酪氨酸激酶（RTK）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路激活外，未识别出特殊的相关性。这支持了在结直肠癌这种基因型和表型相关性很差的疾病中，尽管在基
20、因层面上具有某些共同的驱动因素，但肿瘤的生物学行为仍然有显著差异。通过对基因表达数据以及通路激活信息的详细分析，释放出大量的CMS分型的生物学信息。CMS1型的特点是免疫细胞弥漫浸润相关基因高表达，主要涉及TH1和细胞毒T细胞，伴随免疫逃逸通路的高强度激活，这是MSI结直肠癌的一个新特点。CMS2型肿瘤表现为上皮细胞分化，WNT和MYC下游靶点上调，两者均为结直肠癌发生的经典通路。相反，CMS3型虽然也表现为上皮细胞分化，但富含多种代谢产物，被认为与发生KRAS激活突变所需的代谢环境相适应。CMS4型的特点为肿瘤上皮向间质细胞转化（epithelial-to-mesenchymal trans
21、ition，EMT）相关基因表达的明显上调，表现为TGF-信号通路、血管生成、基质重塑通路和补体介导的炎性反应系统的激活。此外，CMS4型肿瘤样本也表现出与基质浸润相一致的基因表达谱，细胞外基质蛋白的过表达及标本中检出更多的非肿瘤细胞。CMS分型与临床指标之间也存在显著关联。CMS1型常见于女性右半结肠癌中，表现为相对更高的组织病理分化级别。与之相反，CMS2型主要见于左半结肠癌，而CMS4型确诊时的肿瘤分期相对较晚（TNM分期中的、期）。CMS分型与患者预后也存在相关性：CMS4型的总生存率和无复发生存率更低；CMS2型复发后的生存率更高； CMS1型的复发后生存率很低，这与近期研究发现存在
22、MSI和BRAF突变的复发结直肠癌患者预后更差是一致的。四、未来与展望精准医学规划了人类战胜疾病并保持健康的未来与愿景，它不仅将重新界定疾病分类，还必然会深刻影响医生的临床实践与患者的预后转归。而癌症是精准医学计划的研究重点。我们目前尚处在筛选癌症关键基因的初步阶段，更艰巨的任务是找到干预或治疗的理想手段。许多重要的癌症相关基因（如P53、RAS等）虽已研究多年，但目前仍缺乏应用于临床的有效药物。免疫治疗也仅提供了一种选择，寻找更多的治疗策略还面临重大挑战。多基因调控、多种组学参与、细胞的异质性以及基因型与表型间的差异等都是癌症的基本特征，癌症精准医学计划任重而道远。结直肠癌的治疗目前仍以手术切除和综合治疗为主，随着MSI、MMR、EGFR、KRAS、NRAS和BRAF等分子检测手段从实验研究进入了临床应用，结直肠癌已经跨入分子诊断和治疗的时代。继胶质母细胞瘤和卵巢癌之后，结直肠癌是第3个被TCGA计划项目组发布癌症基因组信息的恶性肿瘤。我们完全有理由相信，随着人类结直肠癌基因组数据的进一步解析，传统结直肠癌的诊疗模式必将被改变，结直肠癌精准医学将重新规划肿瘤分类、预防、诊断、治疗、评估预后以及护理等各个临床实践节点。外科医师应该加以学习和关注精准医学，更新诊治理念，以期为结直肠肿瘤患者的个体化精准医疗提供进一步的支持。作者：姚宏伟 舒畅 胡松年 刘荫华
