1、 1 一 、概念:1. 旁侧序列(侧翼序列 :存在于结构基因的第一个和最后一个外显子外侧的一段不被转录的非编码区。2. 断裂基因:真核生物的结构基因的 DNA 序列(转录部分由编码序列和非编码序列两部分组成,编码序列(外显子是不连续的,被非编码序列(内含子分割开来,形成 镶嵌排列的断裂方式,故真核基因又被称为断裂基因。3. 顺式作用元件:是指与靶基因处在同一条染色体 (DNA 上, 起调控作用的 DNA 序列。通常不编码蛋白质,位于基因的旁侧或内含子中,包括启动子、增强子、终止子、反应 元件和沉默子等。4. 反式作用元件:能特异地结合靶基因的顺式调控元件上 , 来调控另一个基因表达的基因编码产
2、物 (蛋白质或 RNA (microRNA , piRNA 等称为反式作用因子,编码反式作用因子 的基因与受调控的基因多半不在同一条染色体上。5. RNA 编辑:某些 RNA ,特别是 mRNA 前体的一种加工方式,如插入,删除,或取代一些核苷酸残基,导致 DNA 所编码的遗传信息发生改变,成为 RNA 编辑。 6. 因沉默机制被称为 RNA 干扰(RNAi 。7. 基因打靶:是利用活细胞染色体 DNA 可与外源 DNA 的同源序列发生同源重组的性质 ,以定点修饰改造染色体上某一基因的方法。8. 基因组 DNA 文库:将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的
3、 DNA 片段,与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞 , 在培养 基上选择性生长的阳性菌落的集合称基因组 DNA 文库 , 简称 G -文库。 9. cDNA 文库:以来源于特定(类型或发育阶段组织的 mRNA 为模板,用逆转录酶合成 cDNA ; 与含有某一种限制酶切点的双链寡核苷酸接头连接后, 用该酶切割成粘性末端, 与载体连接后转化宿主细胞 , 由此得到的所有阳性菌落总和 , 称该组织的 cDNA 文库 .10. 遗传异质性:几个基因中的任何一个发生突变都可以导致相同的表型。遗传异质性的存在也阻碍了基因定位的进程11. 单亲二倍体:所有染色体(2n 来自父或母单方的二倍体。在胚胎时
4、夭折,父源的就形 成葡萄胎,母源的就形成卵巢畸胎瘤。12. 单亲二体型:一对同源染色体都来自父或母方,一般三体型丢失一条后其数目正常,但都来自于单亲。13. 早现遗传:一些遗传病表现出连续世代传递中发病年龄提早,病情也加重,这种现象就称为早现遗传。这与动态突变中三核苷酸拷贝数的扩展程度有关。14. 遗传印记:双亲的基因或染色体存在功能上的差异,因而基因来自父方或母方而产生不同表现型的现象。这是由于生殖细胞分化过程中受到不同修饰的结果。15. 动态突变:某些遗传性疾病与三核苷酸重复拷贝数的扩展有关,三核苷酸重复拷贝数在正常情况下有一定的变异范围,而扩展时就表现为疾病,这种突变不稳定,其拷贝数与
5、病情正相关16. 易患性:遗传因素和环境因素共同作用并决定一个个体是否患病的可能性,个体患病的可能性有高有低,大多数为中等水平17. 易感性:遗传因素决定一个个体患病的风险(遗传因素:若干微效而具有累积效应的致 病基因 。在复杂疾病中,若干作用微小但有累积效应的致病基因构成了个体患某种病 的遗传因素18. 数量性状:在群体中不可分出具有和不具有该性状的全部群体,性状的变异在群体中的 分布是连续的,单峰。19. 肿瘤抑制基因 (TSG:存在于正常细胞中能够抑制细胞恶性转化,对细胞的增殖起负性 调节作用的基因,其失活使正常细胞增殖失控,进而转化形成肿瘤细胞。20. 癌基因:存在于致癌病毒、人和动物
6、细胞中能导致细胞恶性转化的核酸片段,促进细胞 的生长和增殖。21. 微卫星不稳定 (MSI:指基因组中微卫星 DNA 重复序列的增加或减少所导致的遗传性改 变。22. 端粒:是位于细胞染色体末端的一种特殊结构,由端粒 DNA 序列和端粒相关蛋白(端 粒酶, TRF1, TRF2等组成,对染色体具有保护作用。23. 端粒酶:由 RNA 和蛋白质组成的复合体,以核内 RNA 为模板合成 DNA 的反转录酶。 24. .RFLP :又名限制性片段长度多态性,使用限制性 DNA 内切酶消化某个 DNA 分子后出 现的长度多样性。25. VNTR :基因组内广泛存在串联重复序列,串联重复首尾相连。在群体
7、中不同的个体或 不同的染色体中,其串联重复的拷贝数不同而产生的多态。26. 间接基因诊断:应用基因内或基因近旁 DNA 多态为遗传标记进行连锁分析,判断是否 获得了带有致病基因的染色体而作出诊断。27. 基因治疗:应用 DNA 重组技术,将外源目的基因转移到患者体内,使其正常表达,补 偿或替代原基因的缺陷和异常而达到治疗目的。28. 反义核酸技术:以反义寡核苷酸或者反义 RNA 阻断或抑制 DNA 的转录或翻译, 达到靶 向抑制基因表达。二、简答:1. 简述 DNA 结构的基本特征和生物学意义。DNA 结构基本特征: A =T 、 C G 互补配对 结合;碱基的排列顺序就是 DNA 序 列储存
8、 遗传密码 ;双螺旋互补结构是 DNA 复制和修复 的基础;双螺旋的沟,尤其 是大沟为蛋白质分子结合的场所; 双螺旋的互补性是分子识别的原理之一, 也是现代分子 技术核心技术分子杂交的基础。生物学意义:它是遗传信息的载体, 贮存并传递支配生命活动的指令; 它是构建生 物体的蓝图; 它是人为操作、 研究生命和改造生命特征的元件; 它是生命科学技术遵循 的原则。2. 简述线粒体 DNA 的遗传学特征。 mtDNA 是半自主性,能独立复制、转录和翻译; Mi 基因组的遗传密码与普通密码 不同; mtDNA 为母系遗传; mtDNA 突变率高; mtDNA 具有阈值效应的特性; mtDNA 的进化率极
9、高。3. 何为转座子?简述转座子的转座途径?转座子:细胞中能改变自身位臵的一段脱氧核糖核酸(DNA 序列,或存在于染色体 DNA 可自主复制和移位的基本单位。转座途径:复制转座 : 转座因子在转座期间先复制一份拷贝,复制的拷贝转座到新的 位臵, 在原先的位臵上仍然保留原来的转座因子。 复制转座有转座酶和解离酶的参与。 转座 酶作用于原来的转座因子的末端, 解离酶则作用于复制的拷贝。 非复制转座 : 转座因子直 2 3 接从原来位臵上转座插入新的位臵, 并留在插入位臵上。 这种转座只需转座酶的作用。 非复 制转座的结果是在原来的位臵上丢失了转座因子,而在插入位臵上增加了转座因子。4. 反式作用元
10、件通过哪几种常见的基序与顺式作用元件结合来调节基因的表达?亮氨酸拉链基序:为一富含亮氨酸的氨基酸拉链。 典型的为每七个氨基酸组成一个单 体,两个单体形成双聚体呈 Y 形结构;螺旋 -环 -螺旋基序(HLH :长短两个 -Helix 由可 塑性的环结合, 可使两个螺旋折叠而相反结合, 亦可形成异源的二聚体。 这一结构可与特异 基因调节蛋白相互作用;螺旋 -转 -螺旋(HTH 基序:由一短氨基酸分开的两个 -Helix 组成。两个 -Helix 朝不同方向转,故与 HLH 不同,在不同平面,主要由其 C-末端 helix 特 异识别并结合于 DNA 大沟,控制所识别的 DNA 序列;锌指基序:由四
11、个保守的氨基酸 结合一个锌离子形成一个环, 通常是串联重复。 一般由 2个丝氨酸和 2个组氨酸或 4个丝氨 酸结合一个 Zn 2+。 组成一 -Helix 和一 -片层或 2个螺旋, 由 Zn 2+协调, 结合于 DNA 大沟。5. 因, 开放阅读框架是由数个内含子和外显子间相排列的, 故选择剪接的外显子不同所表达的 基因产物不同;原核生物的 mRNA 同时可编码多种蛋白,只编码一中的称单顺反子,编 码多种蛋白的称多顺反子, 其是一种相邻或相互重叠的基因的转录产物, 往往存在前一个编 码序列包含或半包含下一个编码序列的现象,且是由一个操纵子控制;在前体 mRNA 阶 段存在 RNA 编辑,和再
12、编码以及化学修饰等过程,由细胞内环境调节下序列发生改变,表 达不同的蛋白产物6. 细胞 DNA 克隆的主要步骤DNA 克隆 : 将目的基因 /DNA与基因运载体重组, 在宿主细胞中表达 /扩增得到大量相 同 DNA 片段的过程。基本过程:分离纯化目的基因;构建重组 DNA 分子;宿主细胞的转化 ;含 重组体的宿主细胞的筛选、扩增;分离重组 DNA7. 载体的一般特性以及常用载体的种类载体特性:分子量小,以容纳较大的外源 DNA ;有多种限制酶单一识别序列, 有助于外源 DNA 片段插入; 载体 DNA 被切割并插入外源 DNA 后, 不影响其复制能力; 有标记基因,有利于筛选重组体;克隆载体上
13、要有复制起点,表达载体上还要有启动 子。 载体种类:克隆较小片段 DNA 的载体:质粒; 克隆中等大小片段 DNA 的载体: 噬菌体,粘粒载体;克隆大片段 DNA 的载体:细菌人工染色体 (BAC载体,噬菌体 P1载 体;克隆巨大片段 DNA 的载体:酵母人工染色体 (YAC。8. PCR 及 PCR-DHPLC 的基本原理PCR 原理:以合成的两条已知序列的寡核苷酸为引物,在 DNA 聚合酶作用下,将位 于两引物之间的特定 DNA 片段进行复制。通过变性,退火,延伸一个循环,每一个循环的 产物作为下一个循环的模板,反复进行 n 次循环,就可以得到 2n 倍 DNA 。PCR-DHPLC 原理
14、:PCR 扩增后的 DNA 片断通过一个 DNA 分离柱进行分离,经流动 相洗脱的核酸片段通过紫外或荧光检测器检测转换成数字信号储存于计算机中, 然后进行分 析。9. 核酸杂交(Southern 的基本原理、步骤及应用原理:是指 DNA-DNA 杂交 , 以标记的 DNA 探针检测靶 DNA, 应用于 DNA 分子的检测、 分析。应用:克隆基因的酶切图谱分析; 基因的定性及定量分析; 基因突变分析 :缺失、 4 插入 , 影响到酶切位点的点突变; RFLP 连锁分析;步骤: DNA 提取提取组织或细胞的基因组 DNA DNA 分离限制酶消化 DNA ,凝 胶电泳分, 离大小不同的 DNA 片段
15、 DNA 变性:凝胶中的 DNA 在碱性溶液中变性转膜:将变性的 DNA 片段从凝胶原位转移印迹在硝酸纤维素膜或尼龙膜上杂交:将标记的探针 变性,同固着的靶 DNA 片段杂交,与靶 DNA 中的互补 DNA 序列形成异源双链洗膜:未结合的多余 DNA 探针以及非特异性结合的 DNA 探针通过洗膜去除放射自显影:将杂 交的膜进行放射自显影10. 染色质免疫沉淀技术 (CHIP的原理基本原理:在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物,细胞内存在的许多 DNA 与蛋 白质间的相互作用被保留下来。细胞裂解后 , 用超声波或酶将染色质随机切断为一定长度范 围的小片段,然后通过免疫学方法沉淀目的蛋白质与
16、DNA 的复合体,特异性地富集与目的 蛋白结合的 DNA 片段,通过对目的 DNA 片断的纯化与检测,获得蛋白质与 DNA 相互作 用的信息。11. 影响转基因表达的因素影响因素:在一个转基因动物中, 转基因的出现其自身并不足以能产生有功能的产物。 独立获得的带有相同转基因构件的转基因动物,其转基因表达的水平或模式并不一定相同。 表达构件上的序列;宿主基因组内因素。12. 何谓功能克隆?以 F8基因克隆为例简述功能克隆过程。功能克隆:是利用已知性状对应的基因产物, 如蛋白质氨基酸序列的信息, 进行基因定 位,进而克隆该基因。功能克隆:基因功能的研究先于基因鉴定。 31 何谓定位克隆?以 DMD
17、 基因克隆为例概述定位克隆过程。 定位克隆:是先利用连锁分析进行基因定位作图, 然后进行基因克隆, 进一步明确该基 因的功能。定位克隆过程:染色体定位 缩小候选区域邻近克隆群中筛选出结构基因 经筛查突变来确定疾病相关基因。以 DMD 为例:染色体定位:通过连锁分析把 DMD 基 因定位于 Xp21。染色体分析:女性患者,其双亲正常、无家族史,经染色体分析发现都 有 X 染色体和常染色体之间的易位,多个女患常染色体的断点不同,而 X 染色体的断点正 好都在 Xp21,从而进一步将 DMD 基因进一步定位于 Xp21;通过消减杂交克隆法分离 DMD 基因。 Test DNA, 经 Mbo 酶切。
18、driver DNA, 用超声波处理, 多于正常 200倍的量。 两者分别变性后混合,使其复性。然后重组到 BamH 酶切的载体中, test DNA Xp21序列 被克隆。 PERT87-8是其中之一,相当于 DMD 基因内含子 13部分;筛查确定:应用女性 Xp21易位的患者的基因组, 构建基因组文库, 从中寻找含有 rDNA 和 X 染色体序列的克隆, 由此克隆了 XJ ,后来证明该片断相当于 DMD 基因的内含子 17部分。定位克隆:基因定位 ;家系分析:不 符合常显、常隐、性连锁遗传(同胞中患病率1/2或 1/4,患病率 1%10% ;多个等位 基因决定 多基因疾病(不是一对等位基因
19、决定的 ,没有严格的孟德尔传递规律;多 个等位基因 + 环境因素 多因素疾病。14. 多基因遗传病再发风险的估计多基因病再发风险与遗传度密切相关。遗传度增加易患性增加;再发风险代表 平均风险, 在不同家庭中各不相同:由于有家族聚集倾向, 所有患者亲属的患病率高于群体 患病率, 但是亲属再发风险随着与先证者的亲属关系级数递增而剧减; 患病风险随受累亲 属数目的增加而增高; 患病严重程度愈重, 发病风险愈高; 某种疾病随着群体发病率的 降低, 患者亲属的患病风险增加; 当某种多基因病的发病率存在性别差异时, 发病率低的 性别,其后代发病的风险相对较高;发病率高的性别,其后代发病的风险相对较低。 1
20、5. 多基因病易感基因克隆策略家系, 双生子或领养子研究:证明复杂疾病的易感性 (部分是遗传的 ; 分离分析:估计易感等位基因的类型及频率; 连锁分析:定位易感基因座; 群体关联:缩小候选基 因范围;分子生物学:鉴定导致易感性的基因序列变异或表达变化,确定其生化作用。 16. 简述肿瘤染色体异常机制染色体异常主要有两类:染色体数目异常:肿瘤细胞染色体大多数为非整倍体,例如:亚二倍体46; 亚三倍体69; 在培养的肿瘤细胞、 实体瘤、 癌性腹水中常见。其机制主要是:STK15基因中心体异常纺锤体异常染色体分离异 常细胞分裂异常基因组不稳定肿瘤发生; 染色体结构异常:结构异常是由于染色体 断裂重接
21、, 形成特殊结构的染色体, 称为标记染色体:非特异:只见于某种肿瘤的少数肿瘤 细胞中, 对该肿瘤不具有代表性。 特异:经常见于某种肿瘤的大多数或全部细胞, 对该肿瘤 具有代表性,并以其为特征,如 ph 染色体, 14q+染色体等。17. 简述 Knudson 二次突变学说 .二次突变学说是指人类错配修复基因 (MMR的作用方式类似于肿瘤抑制基因。 MMR 基 因功能丧失需要两次突变事件。第一次突变发生在生殖细胞中 MMR Gene 突变,个体对癌 表现易患倾向; 第二次突变发生在体细胞中, 变现为另一等位基因突变, 从而形成纯合子以 至于 MMR 基因功能丧失,故而原癌基因、抑癌基因突变快速积
22、累,细胞增殖失调,引发癌 症肿瘤的的出现 。518. 简述癌基因分类及癌基因激活机制 分类：按原癌基因的产物将 100 多种癌基因分为五大类：以 Src 为代表的酪氨酸激 酶类 （ras,abl） ， 信号转导以 sis 为代表的生长因子类； 以 erb 为代表的生长因子受体类； 以 myc 为代表的核蛋白类和转录因子；以 PRAD1 为代表的细胞周期素、CDK 网络成 分和激酶抑制因子类。 激活机制：在正常细胞中存在着与癌基因极为相似，具有转化潜能的一类基因，称为 原癌基因。原癌基因在个体发育或细胞分裂的一定阶段十分重要，在成体或平时不表达，或 者表达受到严格的控制， 当其因受环境影响而发生
23、突变或被异常激活时， 产生的癌蛋白在性 质或数量上区别于正常细胞， 就可能导致细胞发生恶性转化， 同时原癌基因就转化成癌基因。 激活方式包括四种：基因扩增；突变激活；染色体重排；启动子插入。 19. 简述抑癌基因存在的证据/研究途径. 细胞融合实验小鼠正常细胞与肿瘤细胞杂交培养实验（Harris 和 Klein 等实验） ； Stolet 和 Shimizu 微细胞（单个染色体）转移实验抑癌基因的定位；家族性癌的研 究；杂合性丢失(LOH应用于检测、鉴定 TSG。 20. miRNA 与靶 mRNA 的作用模式？ 二者不完全互补：即二者不完全时配对结合时，主要影响翻译过程而对 mRNA 的稳
24、定性无任何影响；二者完全互补：即二者完全配对结合后，类似 siRNA 与靶 mRNA 的结 合，特异性的切割 mRNA；上述两种模式均具备：当其与靶 mRNA 完全互补配对时，直 接靶向切割 mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。 21. 简述肿瘤十大特征。 .自给自足生长信号；.抗生长信号的不敏感；.抵抗细胞死亡；.潜力无限的复制 能力；.持续的血管生成；.组织浸润和转移；.避免免疫摧毁；.促进肿瘤的炎症；. 细胞能量异常；.基因组不稳定和突变。 22. 何谓 DNA 多态性？DNA 多态的种类及其应用。 DNA 多态性：指在人群中不同个体之间的基因产物大多数是一致的，但每个个体
25、在遗 传上还是有所不同的，这种个体之间的差异从本质上讲是 DNA 碱基序列存在差异，它是通 过用内切酶切割不同个体的基因组 DNA 出现不同长度的片段而被发现的通过孟德尔方式遗 传。 DNA 位点多态性：这种多态性是由控制某些性状的 DNA 碱 基差异造成的。 应用：DNA 位点的多态性导致限制性内切酶切割位点的差异，即限制性片段长度多态性（RFLP）RFLP 是第一代 DNA 遗传学标记；由此发展成了 RFLP 技术（酶切、电泳、转膜、探针杂交，探 针为基因序列或 cDNA） 。 串连重复顺序多态性：应用：DNA 指纹分析；微卫星标记第二代 DNA 标记 ； 单核苷酸多态性：第三代 DNA
26、遗传标记；应用：遗传性疾病研究中却具有重要意义；DNA 测序；DNA 芯片（DNA chip）及微阵列技术 23. 举例说明基因诊断方法。 直接诊断 点突变:限制酶酶切片段长度分析法 / 等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法 /等位特异性 PCR/ PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-DHPLC；缺失：Southern Blot/多重 PCR/多重连接探针 扩增技术 （MLPA） /限制酶酶切片段长度分析法； 间接诊断： 限制性片段长度多态性 （RFLP） /可变数目的串联重复（VNTR）/单核苷酸多态（SNP）/单体型连锁分析 24. 以 ADA 缺乏症、黑色素瘤为例简述基因治疗的基本过
27、程。 6 基因治疗：应用 DNA 重组技术，将外源目的基因转移到患者体内，使其正常表达，补 偿或替代原基因的缺陷和异常而达到治疗目的。以 ADA 缺乏症为例：将 ADA 基因与逆 转录病毒重组， 形成重组子； 同时取 ADA患者的 T 细胞进行增殖培养； 将导入了 ADA 基因的逆转录病毒感染感受态下的 ADA 患者细胞从而使 ADA 基因整合到患者 T 细胞的染 色体上并进行扩增培养； 对大量扩增的 ADA+阳性细胞进行筛选培养； 将完全导入 ADA 基因的的 T 细胞向 ADA 缺失患者回输， 从而通过 ADA 基因的表达恢复 ADA 的缺失打到治 愈疾病的目的。以黑色素瘤为例：从实体肿瘤
28、中获取肿瘤侵润淋巴细胞(TIL，并在 IL-2 条件下培养； 同时将 TNF 基因导入到反转录病毒载体中形成重组子；用重组 TNF 基因 的载体去感染 TIL 细胞使 TNF 基因整合到 TIL 的染色体 DNA 上；对大量扩增的 TNF+ 阳性细胞进行筛选培养； 将完全导入 TNF 基因的的 TIL 细胞向患者回输， 表达 TNF 基因 的 TIL 细胞使肿瘤消退。 25. 基因治疗的策略。 基因添加：导入外源正常基因，使其表达，虽对缺陷基因没有修复和去除，也能达 到治疗目的。主要适用于常染色体隐性遗传病；靶向杀伤特异细胞：导入细胞毒素基因、 药物前体，直接杀伤靶细胞。主要适用于肿瘤和感染性疾病；辅助杀伤特异细胞：将外来 抗原基因或细胞因子基因导入特异靶细胞， 或者将细胞因子基因导入到特异免疫细胞， 增强 对靶细胞的免疫应答反应。主要适用于肿瘤和感染性疾病；靶向抑制基因表达：对特异基 因进行靶向抑制，而对其他正常基因的功能并不影响。主要适用于肿瘤、感染性疾病、变态 反应性疾病、常染色体显性遗传病。靶向修正缺陷基因：通过同源重组法原位修复缺陷基 因，实现定点整合，对靶细胞基因组无影响。主要适用于常染色体显性遗传病。 7
