1、第三章 离心技术l 离心技术是根据颗粒在匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。l1947 Model E全球首台分析型超速离心机。l1947 Model L全球首台制备型超速离心机。l1963 Type 50 Ti全球首个钛金属转头。l1974 Microfuge B全球首台微量离心机。l1976 TJ-6R全球首台冷冻台式超速离心机。l1979 L8 Series全球首先采用微机控制及感应电机驱动的超速离心机系列。l1982 J21-M全球首台采用感应电机驱动的高速离心机。l1984 TL-100全球首台微量台式超速离心机。l1989 Optima Series
2、 首先采用半导体制冷的驱动系统的超速离心机系列。l1989 NVT创新的近垂直转头,可快速提纯DNA样品。l1991 Optima XL-A重新设计的分析型超速离心机。l1994 Avanti J全球独有,利用可变磁阻驱动系统的高效离心。l1996 Optima XL-I拥有两种检测系统的分析型超速离心机。l1998 Optima MAX全球首台超过一百万离心力的台式超速离心。l1998 ARIES全球独有可以自我修正平衡的转头。l2002 Optiam L-XP全球首先采用触幕式操作的超速离心机。l2004 Allegra X-12全球唯一可处理细胞培台式离心机。离心技术的应用：1、应用于工
3、业生产：如化工、制药、食品等工业大型制备。离心机转速都在每分钟5000转以下。2、应用于生物、医学、化学等实验室分析研究：分离和纯化样品，以及对纯化样品的有关性能进行研究。第一节 基本原理一、离心力（centrifugal force，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度2X与颗粒质量m的乘积，即：Fc=m2X其中是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。二、相对离心力（relative centrifugal force，RCF）由于各种离心机转子的半径或
4、者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。一般情况下，低速离心时常以rmin来表示，高速离心时则以g(或数字Xg)表示。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。l式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；lg为地球重力加速度（980cm/sec2）；ln为转子每分钟的转数（rpm）。lDole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图。见图4-1。l在用图4-1将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知
5、的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。25.4cm4200rpml例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500g即是RCF值。三、沉降系数（sedimentation coefficient，S）1924年Svedberg对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。若用2n/60表示，则式中X1为离心前粒子离旋转轴的距离；X2为离心后粒子离旋转轴的距离。lS实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒。l 即：1S=
6、10-13秒l 例：某物质的沉降系数是10-12秒l 可写成：10 10-13秒 表示为：10Sl如：核蛋白体为 70S 细胞及细胞内某些成分的沉降系数及其离心条件名称 沉降系数/S RCF/g 转速（rpm）细胞 107 200 1500细胞核 4106-7 600800 3000线粒体 2104 7104 7000 7000DNA 10120 2105 40000RNA 450 4 105 60000Pr 225 74 105 60000四、沉降速度（sedimentation velocity）沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。式中r为球形粒子半径；d为球形粒子直
7、径；为流体介质的粘度；P为粒子的密度；m为介质的密度。从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加，将此式代入上项沉降系数公式中，则S的表示式也可表示为：当Pm，则S0，粒子顺着离心方向沉降。当Pm，则S0，粒子到达某一位置后达到平衡。当Pm，则S0，粒子逆着离心方向上浮。五、沉降时间（sedimentation time，Ts）l在实际工作中，要将某种物质从溶液中分离出来，必须知道所需转速与时间。l如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所需的时间。l根据沉降系数（S）式可得：l积分得：l式中X2为离心转轴中心至离心管底
8、内壁的距离；lX1为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离，那么样品粒子完全沉降到底管内壁的时间（t2t1）用Ts表示则式可改为：l式中Ts以小时为单位，S以Svedberg为单位。六、K系数（k factor）K系数是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。也就是溶液恢复成澄清程度的一个指数，所以也叫“cleaning factor”。原则上，K系数愈小的，愈容易，也愈快将粒子沉降。其中Rmax为转子最大半径；Rmin为转子最小半径。l由其公式可知，K系数与离心转速及粒子沉降的路径有关。所以K系数是一个变数。当转速变，或者离心管的溶液量不同，即粒子沉降的路径改变时，K系数就改变。l通常，离心
9、机的转子说明书中提供的K系数，都是根据最大路径及在最大转速下所计算出来的数值。l如果已知粒子的沉降系数为80S的Polysome，l采用的转子的K系数是323，那么预计沉降到管底所需的离心时间是Tk/S4h，利用此公式预估的离心时间，对水平式转子最适合；l对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间来得快些。第二节 离心机l一、离心机的分类l按转速的大小(机头的额定最高转速)分为:l低速离心机：30103 rmin类型类型 普通离心机普通离心机 高速离心机高速离心机 超速离心机超速离心机最大转速最大转速(r/min)6000 25000 可达可达75000以上以上最大最大RCF（g）6000 8
10、9000 可达可达510000以上以上分离形式分离形式 固液沉淀固液沉淀 固液沉淀分离固液沉淀分离 密度梯度区带分离或差密度梯度区带分离或差 速沉降分离速沉降分离转子转子 角式和外摆式角式和外摆式 角式、外摆式角式、外摆式 角式、外摆式、区带角式、外摆式、区带仪器结构仪器结构 速率不能严格控制，速率不能严格控制，有消除空气和转子间有消除空气和转子间 备有消除转子与空气摩擦备有消除转子与空气摩擦性能和特点性能和特点 多数室温下操作多数室温下操作 摩擦热的制冷装置，摩擦热的制冷装置，热的真空和冷却系统，热的真空和冷却系统，有有 速率和温度控制较准速率和温度控制较准 更为精确的温度和速度控更为精确的
11、温度和速度控 确、严格。确、严格。制、监制、监 测系统、有保证转测系统、有保证转 子子 正常运转的传动和制动正常运转的传动和制动 装置等。装置等。应用应用 收集易沉降的大颗粒收集易沉降的大颗粒 收集微生物、细胞收集微生物、细胞 主要分离细胞器、病毒、主要分离细胞器、病毒、（如（如RBC、酵母细胞等）、酵母细胞等）碎片、大细胞器、碎片、大细胞器、核酸、蛋白质、多糖等甚至核酸、蛋白质、多糖等甚至 硫酸铵沉淀物和免疫硫酸铵沉淀物和免疫 能分开分子大小相近的同位能分开分子大小相近的同位 沉淀物等。但不能有沉淀物等。但不能有 素标记物素标记物15N-DNA和未和未 效沉淀病毒、小细胞器效沉淀病毒、小细胞
12、器 标记的标记的DNA。（如核糖体）、蛋白质等大分子。（如核糖体）、蛋白质等大分子。二、离心机的结构 低速离心机：其主要部件是电机和转轴。高速、超速离心机：驱动电机、制冷系统 真空系统（超速离离心机有）显示系统、自动保护系统 控制系统组成三、离心转子和离心管（一）离心转子 离心转子是超速、高速离心机的主要部件之一。由于超速、高速离心机工作时的转速很高，相应的离心力场则很大，离心转头均用高强度的铝合金、钛合金及超硬铝、锻铝制成。1、离心转头的分类（1）角转子(nxedanglerotor)角转子是各种类型离心机的基本转子和最高速转子。特点：角转头常用铝或钛合金制作，呈圆锥形。角 转头中离心管的中
13、心线与旋转轴的夹角一般 在15 40之间。优点：具有强度高，重心低，运转平稳，离心时间 短，寿命长，使用方便等。缺点：具有壁效应，即靠近离心管外壁部形成强烈对流和涡旋，影响分离纯度。应用：常用于差速离心来分离s（沉降系数）值相差较大（1：10）的样品。规格：角转头的规格较多，常见的有3215ml，650ml等。（2）水平转头(swing-outrotor)特点：铝合金或钛合金制成。离心管放人吊篮中，离心时，离心管中心线与旋转中心线由平行而逐渐变为垂直。减少了由于对流和涡旋而引起的壁效应，提高了分离纯度。增加了沉降距离，所以离心时间也相应增长。用途：速度区带离心（3）垂直转头(verticalr
14、otor)特点：垂直转头是一种角度转头，离心管垂直放置。离心管与。应用：等密度区带离心 sucrose速度区带离心 通常将离心管(加离心管帽或加可热封的塑料管)密封后垂直插入转头内。离心前，离心管中的样品液受重力的作用液面呈水平分布。离心时，由于离心力作用使液面由水平分布转为垂直分布，被分离颗粒沉降在后半管壁。这种由于离心作用使液面重新转向分布称为再定向。图 （a）水平转子；（b）固定转角转子；（c）垂直离心管转子2、离心转头的常用标记及转头参数（1）转头标记的意义 符号：角度转头FA，垂直转头V；甩平转头Sw；连续转头CF；区带转头Z。英文字母后的数字表示该转头的最大额定转速。Ti表示由钛或
15、钛合金为材料制成的转头，不标则为铝或铝合金做成的转头。如：SW65Ti指该转头为甩平转头，最大额定转速为65 000rmin，转头由钛金属制成。(2)转头参数 Rmax：从转轴中心至离心管最外缘或离心管底的距离；Rmin：从转轴中心至离心管最内缘或离心管顶的距离；RPMmax：转头的最高安全转速；FRCmax：转头以只fM，运转时，在Rrna处的相对离心力；FRCmin：转头以RPMmax运转时，在Rmin处的相对离心力；K：衡量转头相对效率的量，K值愈小，效率愈高，所需离心时间就愈短。（二）离心管 常用的塑料离心管:聚乙烯管(PE)、纤维素管(CAB)、聚碳酸酯管(PC)和丙二醇酯管(PP)
16、等。离心管有各种大小:1.5ml到1000ml。选择离心管时应考虑下列的一些性能。1)容量：由样品的体积决定。注意在有些应用中（如高速离心）离心管必须装满。2)形状：做收集沉淀时，用圆锥性管底的离心管较好；而进行密度梯度离心时圆底离心管更有用。3)最大离心力：详细信息由厂家提供。4)耐腐蚀性：玻璃管是惰性物质，但绝对不能在高、超速离心机上使用。聚碳酸酯管对有机溶剂（如乙醇、丙酮）敏感，而聚丙烯管具有更好的耐腐蚀性。详细信息可参考厂家的说明书。5)灭菌：一次性塑料离心管出厂时通常是消过毒的。玻璃管及聚丙烯管可重复灭菌使用。多次高压灭菌可能会导致聚碳酸酯崩裂或变形。6)透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透
17、明的，而聚丙烯管为半透明。7)能否刺穿：若想用刺穿管壁的方法收集样品，纤维素乙酸管和聚丙烯管易于用注射管针头刺穿。8)管帽：大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用以防止使用过程中样品漏出并在离心过程中支撑离心管，防止其离心时变形。对于放射性样品，即使是低速离心也一定要盖管帽，并且要使用与所用离心管配套的管帽。第三节 离心技术一、离心技术的分类：根据离心原理，按照实际工作的需要，目前已设计出许多离心方法，综合起来大致可分三类。平衡离心法根据粒子大小、形状不同进行分离，包括差速离心法（differential velocity centrifugation）和速率区带离心法（rate zon
18、al centrifugation）。等密度离心法（jsopycnic centrifugation）又称等比重离心法，依粒子密度差进行分离，等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。经典式沉降平衡离心法用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化等。二、离心分离的方法（一）差速离心法 差速离心法是利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的
19、物质。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点：分离效果差，不能一次得到纯颗粒；分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀。颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。例如用差速离心法分离细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。（二）密度梯度离心法：（二）密度梯度离心法：密度梯度离心法是样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡
20、，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。优点：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的 颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防 止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点：离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不宜掌握。1、速率区带离心法 速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率沿管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开
21、，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降的越快，所呈现的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。2、等密度离心法 等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有颗粒的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，梯度液由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时浮力密度不同的颗粒，在离心力场下，或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带。所形成的区带，与样品粒子的密度有关，而与颗粒的大小和其他参数无关。因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这
22、些粒子的成带位置。此法一般用于分离大小相近，而密度差异较大的物质。（三）梯度溶液的制备1、梯度材料的选择原则 与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。不会对离心设备发生腐蚀作用。容易纯化，价格便宜或容易回收。浓度便于测定，如具有折光率。对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。这些条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。梯度材料：糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaC
23、l、KBr等。有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）硅溶胶：如Percoll。蛋白质：如牛血清白蛋白。重水。非水溶性有机物：如氟代碳等。（四）分析性离心 离心除了用于制备外，还可用于样品的定性定量分析。在离心机上装备光学系统，采用特殊的透光离心池，在离心过程中可以直接观察样品颗粒的沉降情况，以对样品进行定性定量分析。第四节 离心机的使用及注意事项一、低速离心机的使用：1、开机：将待离心溶液倒入大小适中的离心管中（溶液量不应超过离心管总体积的2/3）。离心管连同管套一起放在粗天平上平衡（管套底部应放置橡皮垫）。对称放入离心机插孔中（不用的管套应拿出），盖紧上盖。开关置于“关”，
24、调速旋钮置于最小，接通电源，打开开关，缓慢启动。用调速旋钮沿顺时针方向缓慢调速，观察转速，达到转速后开始计时。2、关机：停转后打开上盖，轻轻取样。关掉开关，切断电源。离心管套倒立放置，使其干燥。二、离心机使用注意事项1、精密地平衡离心管及其内容物。超速离心机转头是镶置在一根很细的轴上，因此在两支离心管平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围。制备性超速离心机两离心管平衡时重量之差不得超过0.1g。有的普通离心机带有离心管套筒，平衡时应带上套筒。一台离心机的套筒只能在该离心机上使用，不能在离心机之间(特别是不同型号的离心机之间)混用套筒。2、平衡后的一对离心管及其内容物(有时还可能包
25、括离心管套筒)应对称放置，不能错位，不能装载单数的管子，以免因离心所产生的离心力不对称而损坏离心轴。3、当平衡的离心管及其内容物(或包括套筒)对称放置好后，盖好离心机盖子，打开电源，转动速度调节旋钮，逐步增加到所需要的离心速度，计算离心时间。l4、当离心到达所需要的时间后，再转动速度调节旋钮减速。待离心机自然停止转动后取出离心管。l关闭离心机电源，拔掉电源插，清洁整理离心机、离心管、套筒、天平等。5、超速离心机带自动控制的操作系统，待选定离心速度、时间等参数后，按启动开关，离心机即自动开始转动、记录时间，并可自动停机(取决于输入的控制信号)。在离心室被抽成真空前，离心机只作低速运转。6、超速离
26、心时，应注意选择合适的离心管和转头。根据待离心液体性质及体积选择合适的离心管，装载液体时要按各种离心机具体操作说明进行。有的离心管无盖，液体不能装得过多，以防离心时甩出，造成转头生锈或被腐蚀。制备性超速离心机的离心管，常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管上部凹陷变形。l根据转速选择合适的转头，当转速超过所用转头最大转速的 2.5时，转头就会爆炸。l离心完后，转头应用温水洗涤并干燥，一般水洗就足够了，如必须使用去污剂时应用中性去污剂，不可用碱性去污剂。用中性去污剂擦拭转头，用水除去全部去污剂再用蒸馏水冲净。切勿将转头浸泡在去污剂中。l洗净的转头放在室温中干燥，更好的办法是将转头擦干，用理发吹风机吹干，转头长期不用应涂一层上光蜡保护。转头在使用中应防止与其他物品碰撞，避免造成伤痕，如果发现有被腐蚀迹象，转头不应再用。
