1、第五章第五章 双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2D-PAGE)蛋白质组分析的技术路线蛋白质组分析的技术路线双向凝胶电泳技术的发展及原理双向凝胶电泳技术的发展及原理仪器简介仪器简介样品制备样品制备技术流程技术流程1.蛋白质组分析的技术路线蛋白质组分析的技术路线要求要求流程流程技术路线技术路线蛋白质组分析的首要要求蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析和分析。生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样
2、品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得蛋蛋白白质质组组分分析析流流程程蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的
3、蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定2.双向电泳技术的发展及原理双向电泳技术的发展及原理双向凝胶电泳的发展双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理双向凝胶电泳的基本原理 双向凝胶电泳的发展双向凝胶电泳的发展双向凝胶电泳的思路最早是由双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和和Poulik提出提出(Smithies O,Poulik MD.Two-dimensional electrophoresis of serum proteins.
4、Nature,1956,177:1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率(free-solution mobility)，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。随后，随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳(Raymond S,Weintraub L.Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.Science,1959,30:711)，双向电泳的支持介质逐
5、渐转向聚丙烯酰胺凝胶，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶(Margolis J,Kenrick KG.Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyac-rylamide disc and gradient gel electrophoresis.Nature,1969,221:1056-1057)，这即是双向凝胶电泳这即是双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2D PAGE)。同年，同年，2D PAGE在原理上又有了新的
6、发展，以第一向为蛋白质等电聚焦在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术建立起来，即的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE(Dale G,Latner AL.Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis.Clin Chim Acta,1969,24:61-68；Macko V,Stegemann H.Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophore
7、sis identification of varieties.Hoppe-seylers Z Physiol.Chem,1969,350:917-919)。20世纪世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠(SDS)(Barrett T,Gould HJ.Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins.Biochim Biophys Acta,1973,294:165-170；Martini OHW,Gould H.J.Enumeration of rabb
8、it reticulocyte ribosomal proteins.J Mol Biol,1971,62:403-405；Stegemann H.proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen.Angew Chem,1970,82:640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础，即现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。197
9、5年，年，OFarrell、Klose和和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳建立了高分辨率的双向凝胶电泳(OFarrell PH.High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.J Biol Chem,1975,250:4007-4021；Klose J.protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues.A novel appr
10、oach to testing for induced point mutations in mammals.Humangenetik,1975,26:231-243；Scheele GA.Two-dimensional gel analysis of soluble proteins.J Biol Chem,1975,250:5375-5385)。此项此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一般能分离般能分离1000 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质个左右
11、的蛋白质点。点。双向凝胶电泳的基本原理双向凝胶电泳的基本原理先将蛋白质根据其等电点在先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。第二次电泳分离。第一向进行等电聚焦第一向进行等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)，由于蛋白质具有两性解离，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性和等电点特性，将蛋白质样品加载至将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动带电荷相反的电极方向移动。移动
12、过程中移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子蛋白分子可能获得或失去质子，并随并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电点点 pH 区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动。同样同样，如果蛋白如果蛋白质扩散到高于其等电点的质扩散到高于其等电点的 pH 区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极移区域时，则带负电，在电
13、场的作用下会向阳极移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH 梯度介质区梯度介质区域内。目前常使用预制胶条域内。目前常使用预制胶条(IPG,immobilized pH gradient)用于蛋白质的等电用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的聚焦分离，将聚焦好的 IPG 胶条在含有胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。的缓冲液中平衡。第二向是将在第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量(M
14、W)大小与第一向相垂直的分离。沿大小与第一向相垂直的分离。沿垂直的方向进行垂直的方向进行 SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。IPG 胶的材料是胶的材料是 Immobilines，为拥有，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在基或叔氨基团，它们构成了分布在pH 310不同值的不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的缓冲体系。根据公布的
15、配方计算后，将适宜的IPG试试剂添加至混合物中用于凝胶聚合剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状分离达到真正的平衡状态。态。三种双向凝胶等电聚焦系统三种双向凝胶等电聚焦系统根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：统：ISO-DALT、NE
16、PHGE和和IPG-DALT。在在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶(tube gel)中进行，载中进行，载体两性电解质体两性电解质(carrier ampholyte)在外加电场的作用下形成在外加电场的作用下形成pH梯度，梯度，pH梯度梯度在碱性区不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低是其主要缺点，在碱性区不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低是其主要缺点，并且一般不能分离等电点大于并且一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质，其优点是电泳设备要求不高，的碱性蛋白质，其优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于开展工作，各种电泳条
17、件经优化后，可达到非常高电泳溶液容易配制，易于开展工作，各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，目前唯一分辨到的分辨率，也可获得好的重复性，目前唯一分辨到10000个蛋白质斑点的图谱个蛋白质斑点的图谱正是采用了这一系统。正是采用了这一系统。NEPHGE为非平衡为非平衡pH梯度电泳梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis)，是，是IPG(immobilized pH gradient)胶发明前用于分离碱性蛋胶发明前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电聚焦场中达到平衡前结束电泳，第一向的白质的一种方法，蛋白质在等电
18、聚焦场中达到平衡前结束电泳，第一向的pH也是依靠载体两性电解质和电场来建立。也是依靠载体两性电解质和电场来建立。IPG-DALT的第一向电泳是采用的第一向电泳是采用1982年发明的年发明的IPG胶胶(Bjellqvist B,Ek K,Righetti PG et al.Isoelectric focusing in immobilized pH gradient:principle,methodology and some applications.J Biochem Biophys Methods,1982,6:317-339)，其，其pH梯度的形成依赖于不同梯度的形成依赖于不同pK值的一
19、种合成的化合物值的一种合成的化合物immobiline，该，该化合物是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱减，在凝胶聚合过程中，化合物是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱减，在凝胶聚合过程中，能与聚丙烯酰胺共价结合，因此，能与聚丙烯酰胺共价结合，因此，IPG胶的胶的pH梯度是稳定的，不依赖于外加梯度是稳定的，不依赖于外加电场，基本上克服了电场，基本上克服了ISO-DALT的主要缺点，无论在重复性和上样量上均优的主要缺点，无论在重复性和上样量上均优于于ISO-DALT。非变性非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观
20、分子量同生理条件下获得的这些蛋白的白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；值是一样的；非变性非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性：第一向采用非变性IEF，之后在，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白非共价键连接的蛋白-蛋白间的相互作用。蛋白间的相互作用。非变性非变性/还原还原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下：非变性条件下IEF聚焦，之后用聚焦，之后用8M尿素尿素+5%-ME+2%SDS进行平衡，再进行第二向进行平衡，再进行第二向SDS-PAGE电泳。此
21、时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。肽的信息。变性变性2D-PAGE：样品先用：样品先用2%SDS+5%-ME+95变性变性5min,IEF在在8M尿素尿素+1%NP-40条件下进行，之后胶条用条件下进行，之后胶条用2%SDS+5%-ME平衡，然后进行平衡，然后进行SDS-PAGE。该技术适于。该技术适于DNA序列和序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起
22、的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100KD的蛋白质的蛋白质点少于第三种方式。点少于第三种方式。双向电泳的分类双向电泳的分类3.仪器简介仪器简介第一向：第一向：采用珀耳帖温度控制聚焦平台；最大电压采用珀耳帖温度控制聚焦平台；最大电压为为10,000伏；有不同的电压上升方式；可分步伏；有不同的电压上升方式；可分步进行时间或电压进行时间或电压小时控制；重泡胀可采取整体小时控制；重泡胀可采取整体的或独立的步骤；程序可时时控制；可同时聚的或独立的步骤；程序可时时控制；可同时聚焦焦24根根7cm，12根根17cm胶条；有三个预设程序胶条；有三个预设程序的方法；
23、有十个用户自定方法；采集运行数据的方法；有十个用户自定方法；采集运行数据可经可经RS232端口输出或任何热敏打印纸。端口输出或任何热敏打印纸。BIO-RAD公司公司PROTEAN IEF Cell 等电聚焦仪：等电聚焦仪：Amersham pharmcia Biotech公司公司IPGphor等电聚焦仪：等电聚焦仪：电极区域为铜镀金板电极区域为铜镀金板；最多上最多上12个样品个样品；平台温度为平台温度为18-251；胶胶条槽条槽(Holder)体为氧化铝陶瓷，丙烯酸的盖子；适合体为氧化铝陶瓷，丙烯酸的盖子；适合7、11、13和和18cm的胶的胶条条；程序参数包括重泡胀时间程序参数包括重泡胀时间
24、、平台温度平台温度、每根胶条的最大限流每根胶条的最大限流、每步的电每步的电压压、每步的电流改变模式每步的电流改变模式、每步的时间每步的时间；可编辑可编辑10个程序个程序，每个程序分有九每个程序分有九个步骤个步骤；电压输出最大为电压输出最大为8000V；最大电流为最大电流为1.5mA；最大功率为最大功率为12W。第二向：第二向：BIO-RAD公司公司PROTEAN II xi Cell电泳槽：电泳槽：电极是直径为电极是直径为0.01英寸的白金电极；适用于英寸的白金电极；适用于16.520cm 凝胶电泳；凝胶凝胶电泳；凝胶厚度为厚度为1.0mm；可同时运行；可同时运行1-2块胶；上槽缓冲溶液块胶；
25、上槽缓冲溶液350ml，下槽缓冲溶液，下槽缓冲溶液1.2 L；典型；典型SDS-PAGE电泳时间：无冷却时为电泳时间：无冷却时为5小时，带冷却时为小时，带冷却时为3.5小时。配套小时。配套电源为电源为Power Pac 1000：在进行电泳时，最大电压不超过：在进行电泳时，最大电压不超过1000V，最大功率不，最大功率不超过超过80W，最大室温不超过，最大室温不超过50。Amersham pharmcia Biotech公司公司Ettan DALT II System：(1)此系统的电源控制为此系统的电源控制为Power Supply/Control Unit：最大输出功率是：最大输出功率是2
26、00W；温度控制范围是；温度控制范围是10-50最大电压最大电压600V；最大电流；最大电流1A。(2)使用使用Gel caster灌胶模具：最多可同时灌灌胶模具：最多可同时灌25.520.5cm、1mm厚的梯度胶或均一胶厚的梯度胶或均一胶14块。块。Amersham pharmcia Biotech公司公司Hoefet miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit：胶大小为胶大小为10.08cm;最多可同时跑两块胶；跑一块胶时需最多可同时跑两块胶；跑一块胶时需1.7L电极缓冲液电极缓冲液，跑两块胶时需跑两块胶时需1.2L电极缓冲液电极缓冲液；
27、最大电压是最大电压是600V，最大功率是最大功率是25W；所配置电所配置电源为源为Electrophoresis Power Supply EPS 301。图像分析软件：图像分析软件：Amersham pharmcia Biotech公司：公司：imageMasterTM 2D version:5.0BIO-RAD公司：公司：PDQuesTM4.双向电泳分析中的样品制备双向电泳分析中的样品制备应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白
28、的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。从而保证待研究蛋白的可检测性。样品的分级处理样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋
29、理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。抽提，按样品溶解度不同进行分离。样品的溶解样品的溶解是是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。成功分离蛋白质的最关键因素之一。1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；的点的强
30、度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。溶解的目标：溶解的目标：增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段变性剂：变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。是尿素和硫尿。表面活性剂：表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白
31、质的疏水基团后，还常经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂、非离子去污剂Triton X-100和和NP-40、两、两性离子去污剂性离子去污剂CHAPS、OBG等等。其中其中CHAPS和和SB3-10最好最好。还原剂：还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加还原剂可使已变在变性剂和表面活性剂联用条件下，加还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底溶解更彻底。常用含自由巯基的常用含自由巯基的DTT或或-巯基乙醇，以及不
32、带电荷的三丁基膦巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦(TBP)进行还原。进行还原。起载体作用的两性电解质：起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小
33、于0.2(w/v)。浓度过高会使。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同实验的精确性，在选择不同pH范围的范围的IPG胶条时，也应使两胶条时，也应使两性电解质的性电解质的pH值与之相符合。值与之相符合。样品中核酸的去除样品中核酸的去除对电泳的影响：对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质(SCA)同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。亚蛋白质组样品的制备亚蛋白质组样品的制备用超离心技术分离出细胞器、质膜和
34、细胞核等成分，再用适用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。要专业仪器，有时会出现假阳性。第一步：用第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的第二步：把未溶解的pellet用标准用标准IEF样品液溶解提取高疏水样品液溶解提取高疏水性蛋白；性蛋白；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽
35、提前两第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。）。顺序抽提法：顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。特殊样品的制备特殊样品的制备低丰度蛋白的分离：低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量,但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小
36、于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3-12、4-12或10-12)进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12)的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12)等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。极端分子量的蛋白质：极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积
37、累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。5.双向凝胶电泳技术流程双向凝胶电泳技术流程IPG重泡涨及样品加样重泡涨及样品加样第一向等电聚焦第一向等电聚焦第二向第二向SDS-PAGE检测检测问题及解决办法问题及解决办法IPG胶条的重泡胀胶条的重泡胀重泡涨时间至少要重泡涨时间至少要10h，泡涨不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收泡涨不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收。重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，操作时需参
38、照相关说明书。重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，操作时需参照相关说明书。不同的不同的加样方法和加样量加样方法和加样量会导致最终结果的差异。会导致最终结果的差异。温度的选择：重泡涨及等电聚焦时温度一般稳定在温度的选择：重泡涨及等电聚焦时温度一般稳定在20，太低尿素会结晶出，太低尿素会结晶出来，温度不稳也会造成胶上的蛋白质点位置的变化。来，温度不稳也会造成胶上的蛋白质点位置的变化。重泡涨时加上重泡涨时加上30-50V的低电压会促进胶条对蛋白质的吸收，但这一点在制备的低电压会促进胶条对蛋白质的吸收，但这一点在制备型电泳时才有意义。型电泳时才有意义。商品化的胶条使用前是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在
39、一起，加样前商品化的胶条使用前是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在一起，加样前需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。重泡涨液的成分是：需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。重泡涨液的成分是：8mol/L Urea,2%CHAPS,18mmol/L DTT,0.5%IPG Buffer,痕量痕量Bromophenol Blue，和裂解，和裂解液成分基本相同，在液成分基本相同，在10-100mmol/L浓度范围内适当提高浓度范围内适当提高DTT的浓度可提高的浓度可提高蛋白质的检测灵敏度。蛋白质的检测灵敏度。重泡涨可在等电聚焦盘内进行，此时样品已经加到重泡涨液中，在加样杯重泡涨可在等电聚焦盘内进行，此时样品已经加
40、到重泡涨液中，在加样杯上样上样(cup loading)方式中，胶条在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等方式中，胶条在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等电聚焦盘内加样。电聚焦盘内加样。泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下内，从而能进行接下来的来的IEF。加样加样样品可以在重泡涨时加入，称为胶内重泡涨样品可以在重泡涨时加入，称为胶内重泡涨(in-gel rehydration)，也可以重泡涨完成后再加入，如加样杯上样。重，也可以重泡涨完成后再加入，如加样杯上样。重泡加样相对不可靠，操作比较困难而且蛋白质容易在胶和样品泡加
41、样相对不可靠，操作比较困难而且蛋白质容易在胶和样品的界面产生沉淀，然而在某些特殊情况下，重泡涨后加样具有的界面产生沉淀，然而在某些特殊情况下，重泡涨后加样具有优势优势，如使用如使用 pH 6-9 的胶条分离碱性蛋白质时，在阳极用加样的胶条分离碱性蛋白质时，在阳极用加样杯加样，可以得到更好的图谱。一般而言，胶内重泡涨是推荐杯加样，可以得到更好的图谱。一般而言，胶内重泡涨是推荐方式，可以增加蛋白质的上样量，也避免了在阴极或阳极加样方式，可以增加蛋白质的上样量，也避免了在阴极或阳极加样的方向问题。的方向问题。分析型双向凝胶电泳上样量在几十至几百微克之间，制备型双分析型双向凝胶电泳上样量在几十至几百微
42、克之间，制备型双向凝胶电泳上样量在数百（银染）到最大几十毫克（考马斯亮向凝胶电泳上样量在数百（银染）到最大几十毫克（考马斯亮蓝染色）之间，上样量的大小和胶条的蓝染色）之间，上样量的大小和胶条的pH范围也有关系，范围也有关系，pH 范围越窄，上样量月大。但由于蛋白质定量方法的重复性并不范围越窄，上样量月大。但由于蛋白质定量方法的重复性并不十分可靠，最佳的上样量要根据实验结果来优化。十分可靠，最佳的上样量要根据实验结果来优化。蛋白载样量蛋白载样量影响影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：胶条对蛋白载样量的因素包括：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需
43、考虑太多其它因素。待研究蛋白的丰度：样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条的pH范围：IPG胶条的蛋白质大约载样量胶条的蛋白质大约载样量IPG Strip lengthAnalytical Load(silver staining)Preparative Load(Coom staining)7cm10100 g/125 l200500ug/125 l11cm50200 g/185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 lIPG IEF 中中 pH梯度
44、的选择梯度的选择 常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。预分步预分步收集收集细胞浆细胞浆细胞核细胞核 细胞膜细胞膜核糖体及其他核糖体及其他特定细胞成份特定细胞成份细胞分细胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH 3-4pH 4-5pH 5-6pH 6-7pH 7-8pH 8-9pH 9-10pH 10-11pH 11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄pH范围阵列分离范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白低丰度或交叉覆盖蛋白阵列那些亚细胞定位位阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质置的功能蛋白质亚蛋白质组阵列策略
45、的框架图亚蛋白质组阵列策略的框架图亚蛋白质组阵列策略的框架图亚蛋白质组阵列策略的框架图亚蛋白质组阵列策略的框架图亚蛋白质组阵列策略的框架图3倍3倍聚焦时间的优化聚焦时间的优化 重泡涨结束后，在胶条和电极之间加上润湿的小纸片，它可以重泡涨结束后，在胶条和电极之间加上润湿的小纸片，它可以吸收盐离子和补充水分。在阴极加上吸收盐离子和补充水分。在阴极加上20mmol/L DTT润湿的纸润湿的纸片可减少碱性端的水平条纹并且有助于碱性蛋白质的聚焦。片可减少碱性端的水平条纹并且有助于碱性蛋白质的聚焦。从理论上讲，获得最好的图谱质量和重复性所需的最佳时间是从理论上讲，获得最好的图谱质量和重复性所需的最佳时间是
46、IEF分离达到稳定态所需的时间。分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和范围和胶条长度通过经验来确定。胶条长度通过经验来确定。等电聚焦
47、的电压上升分为三个阶段首先加上一个比较低的电压，等电聚焦的电压上升分为三个阶段首先加上一个比较低的电压，去出胶条中的过多的盐离子；然后开始加高电压，电压上升的去出胶条中的过多的盐离子；然后开始加高电压，电压上升的模式为缓慢上升；最后是持续高压，电压上升的模式为快速上模式为缓慢上升；最后是持续高压，电压上升的模式为快速上升。一般原则是：根据胶条的升。一般原则是：根据胶条的pH范围和上样量的多少，总电范围和上样量的多少，总电压时间积可以在一定的范围内调整。压时间积可以在一定的范围内调整。IEF的基本条件的基本条件Stemp 1Stemp 2Stemp 3totalvoltageTimeVolt-H
48、oursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStemp 1Stemp 2Stemp 3totaltotalStemp 1Stemp 2Stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-hr5.3 hr7 hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid两维间的平衡两维间的平衡 一维（等点聚焦）电泳结束后可马上进行二维电泳，一维
49、（等点聚焦）电泳结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于也可保存在两片塑料膜间于80保存数月。保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在完整结合，从而在SDS-PAGE 时电泳能顺利进行。时电泳能顺利进行。建议方案是：用含建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6 mM尿素和尿素和30%甘油的甘油的50mM Tris(pH8.8)缓冲液缓冲液先平衡先平衡15min，再用，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代碘乙酰胺取代DTT后后的上述缓冲液平衡的上述缓冲液平衡15
50、min。如果用。如果用TBP代替代替DTT则则只需一步平衡。只需一步平衡。二维二维 SDS-PAGE同普通同普通SDS-PAGE类似。类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，可以把但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，可以把 IPG 胶条看作是压缩胶，因胶条看作是压缩胶，因为在为在 IPG 胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性 IEF 胶（低浓胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶，所以只需使用分离胶（也可使用压缩胶）。度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶，所以只需使用分离胶（也可使用压缩胶）。IPG 胶条平衡好后，一般将胶条在电泳缓冲夜里浸一下，这样一方面可
