1、 第五章、色第五章、色 谱谱 内内 容容 第一节、色谱法的起源第一节、色谱法的起源 第二节、色谱法分类第二节、色谱法分类 第三节、色谱图谱第三节、色谱图谱 第四节、色谱分析的基本理论第四节、色谱分析的基本理论第一节、色谱法的概念第一节、色谱法的概念1.概念概念 色谱法又称色层法、层析法，是用于多组分有机混合物的一种高效 分离技术。2.特点特点 选择性好、分离效能高、灵敏度高、分析速度快等优点。3.先进性先进性 已逐步实现仪器化、自动化、高速化，并从分离手段发展到分析手 段，应用范围不断扩大，分离的对象早已不限于有色物质，但“色谱 法”这一名称一直被沿用。4.范围范围 色谱法与现代新检测技术和计
2、算机技术相结合，已广泛食品质量与 安全等的有关工作，如样品中农药残留量的测定、农副产品分析、食 品质量检验、生物制品的分离制备等。一、色谱法的起源一、色谱法的起源1906年俄国植物学家茨维特首创了这种分离技术把植物叶绿体色素的石油醚浸渍液倒入一根装有碳酸钙吸附剂的细直玻璃柱中，再加入纯石油醚，任其自由流下，原混合物开始被分离成不同颜色的谱带(色素的分离)，且以不同速度通过柱子，然后按谱带颜色对混合物进行鉴定分析。茨维特把这种分离结果称为色谱图，把这种分离方法命名为色谱法。色谱法的本质 色谱法是基于混合物各组分在两相(固定相和流动相)之间的不均匀作用进行分离的一种方法。不均匀作用是先决条件，是各
3、个组分对两相亲和力的不同和向两相不均匀分配的可能性。由于混合物中各组分对两相的亲和力有差异，它们穿过固定相的流动速度(或在固定相中的滞留时间)就有不同，从而得到分离。流动相为气体的色谱分析法称为气相色谱法(GC)；流动相为液体的色谱分析法称为液相色谱（LC）。分为吸附柱层析、离子交换层析、分配层析、凝胶层析 第二节、色谱法分类第二节、色谱法分类一、吸附柱层析：1）.原理:被分离物与吸附剂表面分子的相互作用被吸附，由于不同化合物结构及性质上的差异，在吸附剂上的吸附性能是不同的，在柱色谱分离过程中，用一定的溶剂系统洗脱柱子时，由于溶剂(洗脱剂)与混合物里各组分争夺吸附剂的活性表面，解吸出来的组分与
4、溶剂始终存在着对吸附剂的竞争吸附，不同的物质洗脱剂对它们的洗脱能力也是不同的。2）.特点:因此吸附与解吸始终贯穿整个柱色谱过程，吸附与解吸是吸附柱色谱法的理论基础。吸附过程无选择性，吸附与解吸附过程可逆，但吸附强弱和先后顺序都基本遵循“相似相吸附”的经验规律。3）.常用极性吸附剂:硅胶、氧化铝、聚酰胺。1、举例聚酰胺吸附层析法、举例聚酰胺吸附层析法 1.1原理:属于氢键吸附，聚酰胺通过分子中的酰胺羰基与酚羟基，或酰胺键上游 离胺基与羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附强弱则取决于各种化合物与 之形成氢键缔合的能力。1.2 规律：形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强；形成分子内氢键的化合物，吸附相
5、应减弱。分子中芳香化程度高，则吸附作用强；反之则减弱。1.3 范围：聚酰胺吸附层析特别适合于酚类、黄酮类化合物的制备分离。2、吸附柱色谱的原理、吸附柱色谱的原理 吸附柱色谱是将待分离混合物样品均匀地加在装有吸附剂的柱子中，用适当的溶剂冲洗，由于吸附剂对各组分吸附能力不同，各组分在柱中向下移动的速度不同，吸附力最弱的组分随溶剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。柱色谱装置如图。二、二、离子交换色谱离子交换色谱 1.1原理:以离子交换树脂或表面涂有液体离子交换树脂的固体颗粒为固定相，装在柱中，以水或含水溶剂为流动相，使样品溶液流过交换柱，溶液中的中性分子及具有与离子交换树脂可交换基
6、团相反电荷的离子通过柱子从柱底流出，而具有相同电荷的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上。1.2 规律：由于不同离子与同一树脂交换能力不同，移动速度也不同，在柱上形成色谱带，另选一适当的洗脱剂(含有比吸附物质更活泼的离子)进行洗脱交换，可将吸附物质按先后顺序从柱上洗脱下来，即可实现不同组分物质的分离。1.3 范围：主要用于分离氨基酸，生物碱，糖类化合物。三、分配色谱三、分配色谱 1.1原理:将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等载体上作为固定相，再用与固定相不相混溶的另一相溶剂作为流动相，物质可在两相溶剂相对做逆流移动过程中不断进行动态分配而得以分离。1.2分类:（1）正相层析：固定相采
7、用强极性溶剂，如水、缓冲溶液等，流动相则用氯仿等弱极性溶剂，称之为正相(normal phase)层析；（2）反相层析：以弱极性成分如石蜡油为固定相，流动相则以水、乙腈、甲醇强极性溶剂，则两相可以颠倒，称之为反相(reverse phase)层析，更适合于水溶性成分的分离。液液分配柱层析的分离条件可以基于相应的正相及反相分配薄层层析结果加以选定。四、凝胶色谱四、凝胶色谱1.1 原理:也叫分子筛过滤，利用分子筛分离物质的一种方法。所用载体，如葡聚糖凝胶，是不溶于水，但可在水中膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。当在水中充分膨胀后装入层析柱中。加入样品，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制
8、，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部(即被排阻在凝胶颗粒外部)，所以在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先流出，小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过层析柱时阻力增大、流速变缓，较晚流出。1.2 分类:(1)葡聚糖凝胶 (2)羟丙基葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)。1.3 过程:样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同，故在经历一段时间流动并达到动态平衡，即按分子由大到小次序先后流出并得到分离。第三节、色谱图谱第三节、色谱图谱一一.色谱流出曲线：色谱流出曲线：在色谱分析中，当样品注入色谱柱后，由于各组分与固定相的作用力不同，在随流动相移动的过程中，逐渐在柱
9、中得到分离并随流动相依次流出色谱柱，先后到达检测器。经检测器把各组分的浓度信号转变成电信号，然后用记录仪或工作站软件将组分的信号记录下来，这种组分响应信号大小随时间变化所记录下来的曲线称为色谱流出曲线，也叫做色谱图。Relative Abundance二二.色谱的有关术语色谱的有关术语 色谱图中曲线突起的部分称为色谱峰，由于响应信号的大小或强度与物质的量或物质的浓度成正比，色谱流出曲线实际上是物质的量或浓度时间曲线。理想的色谱流出曲线应为对称的正态分布曲线：Relative Abundance1.基线：在实验操作条件下，只有纯流动相经过检测器时记录下的信号时间曲线称为基线，应该是一条直线，若是
10、斜线就称为基线漂移，如果基线出现上下波动则称为噪声。保持基线平稳，是进行色谱分析的最基本要求。2.色谱峰：是进行色谱分析的主要区域，有峰高、区域宽度和峰面积 三个参数。峰高:是峰顶点与基线之间的垂直距离,以h表示,是色谱 定量分析的依据之一。Relative Abundance区域宽度:a 标准偏差:峰高h 0.607倍处色谱峰宽度的一半，用“”表示。b 半峰宽:w1/2是色谱峰高一半处对应的峰宽。c峰底宽w:色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距。一般来说，区域宽度是色谱峰的重要参数之一，它可以衡量柱效，反映色谱操作的动力学条件，在相同的色谱操作条件下获得色谱峰的区域宽度值越小，说明色谱柱的分
11、离效能越好，柱效越高。峰面积 由色谱峰与基线之间所围成的面积称为峰面积，用“A”表示，是色谱定量分析的基本依据，对理想的对称峰，峰面积与峰高，半峰宽的关系为 A=I.065h x W1/2。3.保留值保留值(retention value)是组分在色谱柱中滞留时间的数值，或在柱中滞留时间内所消耗的流动相体积。保留值主要取决于各组分在两相中的分配情况，当条件一定时，任何一种组分都有一个相应确定的保留值。所以，保留值可以作为定性分析的参数。Relative Abundance3.保留值死时间tM、死体积VM：不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱内的空隙体积
12、,因这种物质其流动速度与流动相流速相近。保留时间hR、保留体积VR：组分从进样到出现色谱峰顶点时所需的时间称为该组分在柱内的保留时间对应于保留时间所消耗的流动相体积称为保留体积VR.调整保留时间：扣除死时间后的保留时间，称为调整保留时间。相对保留值在相同操作条件下，某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值，是一个无量纲量。一组分的色谱流出曲线对色谱分析十分重要，从色谱图上可以获得以下信息：根据色谱峰的各种保留值，可以进行定性分析；根据色谱峰的面积、峰高，可以进行定量分析；根据色谱峰的保留值及其区域宽度，可以评价色谱柱 的分离效能以及相邻两色谱峰的分离程度；根据色谱峰两峰间的
13、距离，可以评价固定相或流动相 的选择是否得当；根据色谱峰的个数，可以判断样品所含组分的最少个 数。第四节、色谱分析的基本理论第四节、色谱分析的基本理论 色谱分析首先是组分的分离，只有当各组分分离之后，才能进行定性和定量分析。两组分色谱峰间的距离与它们在两相中的分配平衡或分配系数有关，两组分分配系数相差越大，两色谱峰间的距离就越大。色谱峰的宽窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，与扩散和传质速率有关。相邻色谱峰有足够大的距离而没有足够高的柱效，区域宽度比较大，同样不能得到满意地分离。色谱分析的基本理论有两个：一个是以热力学平衡为基础的塔板理论；另一个是以动力学为基础的速率理论，两个理论相辅相
14、成，较为满意地揭示了色谱分析中的有关问题和现象。1、分配平衡、分配平衡 分配系数K 在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比，称为分配系数，用“K”表示，即 K值与固定相和温度有关，K值小的组分，每次分配达平衡后在流动相中的浓度较大，因此能较早地流出色谱柱，K值大的组分后出柱。所以，分配系数不同是混合物中有关组分分离的基础。分配比分配比 在一定温度、压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的质量之比，叫分配比，又称容量因子，用 表示，即式中：ms、mm分别为组分在流动相和固定相中的质量称为相比率，是柱型特点参数；K为分配系数。保留比保留比Rs与分配比与分配比 的关
15、系的关系 组分在柱内的平均线速率L与相同条件下流动相在该柱内的平均线速率之比值称为保留比，用Rs表示即 所以，保留比Rs由色谱图可直接计算。Rs也称为滞留因子，它反映了组分在流动相中的分配比例数。例如，某组分完全不被固定相滞留，即该组分100分配在流动相中。2、塔板理论、塔板理论塔板理论最早由马丁(Martin)和辛格(Synge)提出。该理论把色谱柱比作精馏塔，柱内由许多想像的塔板组成,每个塔板的高度为H，称为理论塔板高度。每个塔板内分为流动相和固定相两个部分，流动相占据的板内空间称为板体积。当待测组分进入色谱柱后，就在两相间进行分配并达到平衡，经过许多次分配平衡后，组分得到彼此分离。塔板理
16、论从热力学平衡的角度处理色谱分离过程，解释了为什么流出曲线呈高斯正态分布，论证了保留值与分配比的关系，引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。该理论对色谱柱的分离过程做了如下假设：所有组分开始都进入第零块塔板，组分的纵向扩散(塔板之间的扩散)可以忽略，流动相按前进方向通过色谱柱；流动相进入色谱柱是脉冲式的，是不连续的，每次进入柱中的最小体积为一个塔板体积V；在每块塔板上，待测组分在两相间能瞬间达到分配平衡；分配系数在所有塔板上都是常数，与组分在塔板中的浓度无关。根据以上假设，在色谱分离过程中，若色谱柱是由5块塔板组成(n=5)，某组分的分配比k=1，开始时加到第零块塔板上的质量m=1，分配平衡后
17、ms=mm=0.5，当V体积的流动相进入零号塔板时，将流动相中所含的组分质量0.5推入到第1号塔板上,零号塔板固定相中的组分质量ms=0.5及1号塔板上流动相中的组分mm=0.5，在各自塔板的两相间重新建立分配平衡后，各塔板两相中的组分质量均0.25。以后第零号塔板上每进入V体积的流动相，各塔板的流动相均向前移动一个塔板体积,并重新在两相间建立分配平衡，直至流出色谱柱。经N次分配平衡后，在各塔板上组分质量的分布遵循 (ms+mm)N 二项式展开式。如进入色谱柱V体积的流动相时，N=5，k=1，展开 该组分在色谱柱中占据6块塔板，即第0、1、2、3、4和第5块塔板，各塔板上的组分分布依次为0.0
18、31、0.156、0.313、0.313、0.156 和0.031。如果色谱柱的塔板数n大于50，组分在柱内就可得到较多次的平衡分配，如果以组分流出色谱柱的浓度或量为纵坐标对相应的流出时间，作图，所得到的色谱流出曲线趋于正态分布。此时，进入色谱柱的流动相塔板体积数N已足够大，二项式分布完全可以用正态分布来表示。峰高与理论塔板数n和进样量m成正比，与组分的保留值成反比。当保留值和进样量一定时，理论塔板数越多(柱效高)，色谱峰越高(峰变尖，峰宽变窄)；当理论塔板数和进样量一定时，保留值越大，峰高越低，峰区域变宽，峰形变秃。同一样品中的不同组分在相同条件下测定时，先出的峰高而窄，后出的峰低而宽(矮胖
19、型)。如果不进行校正，不能直接依据峰高或峰面积在不同组分之间比较，进行定量分析。理论塔板数越多，表示色谱柱的分离能力越强 3、柱效和选择性对色谱分离的影响、柱效和选择性对色谱分离的影响(a)两色谱峰距离近且峰形宽，彼此严重相重叠，柱效和选择性都差；(b)虽然两峰的距离相距较远，能很好分离，但峰形很宽，表明选择性好，但柱效低；(c)的分离情况最理想，既有良好的选择性，又有高的柱效。(a)和(c)的相对保留值相同，但分离情况却截然不同。单用柱效还不能真实反映组分在柱中的分离情况，所以引入一个色谱柱的总分离效能指标分离度。1.柱效能柱效能常用有效塔板数(n+)或有效板高(Hd)作为色谱柱的效能指标。2选择性 选择性(即分辨率)就是固定相对于两个相邻组分的相对保留值，也就是某一难分离物质对调整保留值之比。3分离度（R）是两个相邻色谱峰峰尖距离与两峰的平均峰宽之比。R值越大，意味着相邻两组分分离得越好。
