1、代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131谷氨酸的生产谷氨酸的生产 一组一组 1谷氨酸生产现状谷氨酸生产现状工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。目前世界产谷氨酸钠30万吨/年，占氨基酸总量的2/3。我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。2代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521
2、131产生菌株特点：产生菌株特点：革兰氏阳性不形成芽胞没有鞭毛，不能运动需要生物素作为生长因子在通气条件下才能产生谷氨酸谷氨酸生物合成机理：谷氨酸生物合成机理：由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。3代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131.谷氨酸的生物合成途径主要包括：EMP途径HMP途径TCA循环乙醛酸循环CO2固定反应（一）、谷 氨 酸 发 酵 机 制4代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 2009
3、90521131总反应途径总反应途径糖经过EMP途径和HMP生成丙酮酸。一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA；另一方面，经CO2固定作用生成草酰乙酸；两者合成柠檬酸进入TCA循环，由三羧酸循环的中间产物-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。5代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131CO26代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131总反应式和理论转化率总反应式总反应式:C6H12O6+NH3+3/2O2 C5H9O4
4、N+CO2+3H2O理论转化率：理论转化率：（147/180）100%=81.7%7代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131EMP途径和HMP途径生物素充足：生物素充足：HMP途径所占比例为途径所占比例为38%生物素亚适量：生物素亚适量：HMP途径所占比例为途径所占比例为26%8代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131TCA、DCA循环和CO2固定1.TCA循环循环丙酮酸丙酮酸丙糖-3-磷酸乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸TCA氧化CO2固
5、定乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸异柠檬酸琥珀酸乙醛酸乙酰CoA苹果酸柠檬酸合成酶异柠檬酸裂解酶苹果酸合成酶苹果酸脱氢酶2.DCA循环循环9代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131DCA循环的生理意义作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充，特别是以醋酸和乙醇为原料的谷氨酸发酵，它是C4二羧酸的唯一补充来源作为能量供给来源的末端氧化系系10代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131TCA循环和DCA循环以醋酸为唯一碳源的菌体实验表明：菌体内有机
6、酸浓度低到需要DCA循环运转时，由异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶；由于DCA循环运转，TCA循环有机酸过剩，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环运转11代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131在糖质原料的谷氨酸发酵中，在谷氨酸生成期，如果葡萄糖先转化为醋酸，再由DCA循环提供C4二羧酸合成谷氨酸，谷氨酸对糖的转化率就大为减少。3C6H12O6 6丙酮酸丙酮酸 6醋酸醋酸6醋酸醋酸+2NH3+3O2 2C5H9O4N+2CO2+6H2O
7、转化率：转化率：2 147/（3180）100%=54.4%在以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是谷氨酸在以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是谷氨酸生成期生成期DCA循环应该关闭循环应该关闭12代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131丙酮酸丙酮酸 苹果酸苹果酸 草酰乙酸草酰乙酸苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶苹果酸酶苹果酸酶CO2 NAD+NADH+H+PEP+CO2+GDP 草酰乙酸草酰乙酸+GTPPEP羧化酶羧化酶在谷氨酸产生菌中已检出两种在谷氨酸产生菌中已检出两种CO2固定酶：固定酶：磷酸烯醇丙酮酸（磷酸烯醇丙酮酸
8、（PEP）羧化酶和苹果酸酶）羧化酶和苹果酸酶3.CO2固定 13代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131与二磷酸与二磷酸果糖共同果糖共同激活激活PEP羧化酶羧化酶PEP浓度低浓度低PEP易进易进入分解途入分解途径径乙酰乙酰-CoA浓度增加浓度增加转向转向CO2固定固定草酰乙酸草酰乙酸乙酰乙酰-CoA氧化氧化ATP水平提高水平提高抑制丙酮抑制丙酮酸激酶酸激酶所以在谷氨酸发酵所以在谷氨酸发酵中，糖的分解代谢中，糖的分解代谢途径与途径与COCO2 2固定的固定的适当比例是提高谷适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关氨酸对糖收
9、率的关键问题。键问题。TCA循环中循环中间产物浓度间产物浓度增加增加抑制抑制PEP羧羧化酶化酶防止防止过剩过剩生物合成和需能反应生物合成和需能反应解除解除抑制抑制丙酮丙酮酸激酸激酶酶ATP浓度浓度降低降低14代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131氨的导入氨的导入方式：糖代谢中间体糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸氨酸天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给转给-酮戊二酸而生成酮戊二酸而生成谷氨酸合成酶途径谷氨酸合成酶途径15代谢控制发酵文生
10、095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131糖代谢中间体糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶：需：需NADP为辅酶，催化为辅酶，催化-酮戊二酸酮戊二酸的生成（谷氨酸的前体），的生成（谷氨酸的前体），并为谷氨酸脱氢酶提供辅酶并为谷氨酸脱氢酶提供辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶：需：需NADPH +H+为辅酶为辅酶活细胞中，异柠檬酸脱氢活细胞中，异柠檬酸脱氢酶活性小于谷氨酸脱氢酶酶活性小于谷氨酸脱氢酶活性，所以活性，所以NADP浓度是浓度是实际上的限速因子实际上的限速因子柠檬酸柠
11、檬酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸谷谷氨氨酸酸NADPH+H+NADPNH4+16代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131调节机制 黄色短杆菌中，谷氨酸脱氢酶对黄色短杆菌中，谷氨酸脱氢酶对-酮戊二酸和酮戊二酸和谷氨酸表现出同促相互作用谷氨酸表现出同促相互作用，低浓度的，低浓度的-酮戊二酸和谷酮戊二酸和谷氨酸对此酶有显著的激活作用。氨酸对此酶有显著的激活作用。当谷氨酸浓度为当谷氨酸浓度为100mmol/L100mmol/L时，抑制酶活时，抑制酶活6565，浓度为，浓度为400mmol/L400mmol/L时抑制
12、时抑制9090，这比其他的反馈抑制要明显的弱，这比其他的反馈抑制要明显的弱，因而在谷氨酸发酵中菌体内游离出来的谷氨酸浓度就要，因而在谷氨酸发酵中菌体内游离出来的谷氨酸浓度就要高，可以认为这个调节机制对谷氨酸生产发挥着很好的调高，可以认为这个调节机制对谷氨酸生产发挥着很好的调节作用。节作用。17代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131调节机制谷氨酸发酵中，糖代谢除受到生物素控制外，也受到NH4+的影响。使用生物素缺乏菌，在NH4+存在时，葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸。当NH4+不存在时，糖的消耗速度很
13、慢，生成物是-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。18代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131上罐实消培养基的配制32,pH7.0,OD=1.032,pH7.0,1824h冷却接种发酵过程参数测定还原糖的测定谷氨酸的测定菌体形态观察菌体浓度测定发酵过程参数的控制OD值pH温度搅拌速度、DO值通气比：1:(0.080.1)100吨罐前期(012h)3335;中后期(35h)3638pH7.0，流加尿素调节（0.40.6）测定菌体密度，OD值不再上升时，菌体分裂完成，约12h发 酵发 酵 液三角瓶培养固体斜面培养（二）、
14、谷氨酸生产工艺流程191.发酵温度 谷氨酸发酵前期(012h)是菌体大量繁殖阶段，在此阶段菌体利用培养基中的营养物质来合成核酸、蛋白质等，供菌体繁殖用，而控制这些合成反应的最适温度均在3032。在发酵中、后期，是谷氨酸大量积累的阶段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脱氢酶的最适温度在3236，故发酵中、后期适当提高罐温对积累谷氨酸有利。202.pH值pH值对谷氨酸积累的影响 谷氨酸脱氢酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最适pH为7.07.2，当发酵液的pH值偏酸时(pH 5.0-5.8)，谷氨酸脱氢酶受到抑制，代谢向着生成谷氨酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向进行。在发酵后期由于耗用大量NH4+，pH值下降，此时就要
15、进行pH值调节，以保证发酵的正常进行。pH：前期pH（7.58.0），中后期pH（7.07.6）。通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节pH，补充氮源。213.泡沫 在发酵过程中由于强烈的通风和菌体代谢产生的CO2，使培养液产生大量的泡沫，不仅使氧在发酵液中的扩散受阻，影响菌体的呼吸和代谢。给发酵带来危害，必须加以消泡。消泡方法有机械消泡(耙式、离心式、刮板式、蝶式消泡器)和化学消泡(天然油脂、聚酯类、醇类、硅酮等化学消泡剂)两种方法。224.生物素控制1）菌体生长阶段 保证生物素充足，使菌体快速生长2）产酸阶段 控制生物素亚适量(5-10g/L)，使谷氨酸大量积累。235.供氧浓度（通风量）
16、在谷氨酸发酵过程中,通风必须适度。在谷氨酸发酵过程中，发酵前期以低通风量为宜；发酵中、后期以高通风量为宜。实际生产上，以气体转子流量计来检查通气量，即以每分钟单位体积的通气量表示通风强度。另外发酵罐大小不同，所需搅拌转速与通风量也不同。246.NH4+浓度（1）影响到发酵液的pH值（2）与产物的形成有关：NH4+过量：菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产酸阶段谷氨酸会受谷氨酰胺合成酶作用转化为谷氨酰胺；NH4+不足：不利于-酮戊二酸的还原氨基化，-酮戊二酸积累，引起反馈调节257.碳源发酵液中糖含量与谷氨酸的发酵有密切的关系。在一定范围内，谷氨酸的产量随糖含量的增加而增加，但糖含量过高，渗透压过大，
17、对菌体生长不利，谷氨酸对糖的转化率低。发酵液中还原糖的含量一般应控制在10%13%。268.碳氮比 氮源是合成菌体细胞蛋白质、核酸和谷氨酸的氨基来源，大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为100:0.22.0，谷氨酸发酵的碳氮比为100:1521。27 在谷氨酸发酵过程中，应正确控制碳氮比。一般在菌体生长期碳氮比应大一些(氮低），在产酸期,碳氮比应小些(氮高）。在碳源和氮源的比为3 1时，谷氨酸棒状杆菌会大量合成谷氨酸，但当碳源和氮源的比为4 1时，谷氨酸棒状杆菌只生长而不合成谷氨酸。289.发酵时间的控制 不同
18、的谷氨酸产生菌对糖的浓度要求也不一样，其发酵时间也有所差异。低糖(10%12%)发酵，其发酵时间为3638h，中糖(14%)发酵，其发酵时间为45h。29谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系30代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 200990521131谷氨酸的分离与味精谷氨酸的分离与味精的制备的制备31（三）、谷氨酸发酵研究新进展（三）、谷氨酸发酵研究新进展 继续选育各种生化突变菌株：继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富含生物素的转化率提高，或可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓宽原料来源或培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。简化操作工艺。生物工程新技术的应用：生物工程新技术的应用：体外体外DNADNA重组的基因工程和原生质体融重组的基因工程和原生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近合技术和固定化细胞技术使产量提高近1 1倍。倍。改进发酵工艺：改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺，通过电子计算机控制开拓原料，改进流加工艺，通过电子计算机控制发酵条件。发酵条件。32代谢控制发酵文生095-1董晓蒙 200990521117耿春霞 200990521127陈聪聪 20099052113133
