1、生物物质分离工程复习题2014.4名词解释（包括翻译）：凝聚：指在投加的化学物质作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用絮凝剂将胶体粒子连接成网，形成10mm大小絮凝团的过程。渗透汽化(pervaporation)：即通过渗透蒸发膜，在膜两侧组分的蒸汽压作用下，使液体混合物部分蒸发，从而达到分离目的的一种膜分离方法。离子对/反应萃取：就是使目标溶质与溶剂通过配位反应，酸碱反应或离子交换反应生成可溶性的配合物，易从水相转移到有机溶剂系统中。胶束：将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起形成的聚集体就称为胶束。反胶束（r
2、eversed micelle）：是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体临界胶束浓度（Critical Micelle Concentration）：是胶束形成所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示，这是体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。浊点萃取(cloud point extraction,CPE)：一种新型的液-液萃取技术，以表面活性剂胶束的水溶液的溶解性和浊点现象为基础，通过改变实验条件而引起相分离，从而将水溶性物质与亲油性物质分离。增溶作用（solubilization）：表面活性剂在水溶液中浓度达到临界胶束浓度而形成胶束后，能使不溶
3、或微溶于水的有机物溶解度显著增大，形成澄清透明溶液的现象。浊点（cloud point）： 溶液由透明变为浑浊时的温度称为浊点（ cloud point ）液膜分离法(Liquid membrane separation)：又称液膜萃取法(Liquid membrane extraction)以液膜为分离介质、以浓度差为推动力的膜分离操作。支撑液膜(supported liquid membranes)：是由溶解了载体的液膜，在表面张力作用下，依靠聚合凝胶层中的化学反应或带电荷材料的静电作用，含浸在多孔支撑体的微孔内而制得的。细胞破碎（cell rupture）：是指利用物理、化学、酶或机械的
4、方法破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。膜的水通量：是在一定的条件下每单位时间内通过单位膜面积的水体积流量，也叫透水率，即水透过膜的速率。 区带电泳(zone electrophoresis)：即应用支持介质的电泳它表示在一个电场的作用下，样品组成在某一支持物上彻底分离成若干条区带的过程。亲和膜分离(Affinity Membrane Separation)：亲和膜分离技术是将膜分离和层析技术的结合起来的一项技术，有两者结合的亲和膜分离技术，可发挥两者的特色，具有处理量大、选择性强、易于放大等显著优点。亲和载体（affinity escort）：亲和载体的结构包括一
5、个由对生物分子无特异吸附性的物质组成的内核以及内核表面上连接的某些特定基团，这些基团必须对所提取的蛋白质有一定的特异吸附性。等电聚焦电泳（isoelectric focusing electrophoresis）：一种依据静电荷的不同来离析分子的方法，能利用电场和pH梯度的符合作用实现两性物质的选择分离。填空题型：膜的截留率是指对一定相对分子量的物质，膜能截断的程度。定义为 ，如 1，则CP0，表示溶质全部被截留；如 0，则CP=CB，表示 溶质能自由透过膜 。截留率与相对分子质量之间的关系称为截断曲线，较好的膜应该有陡直的截断曲线，可使不同相对分子质量的溶质完全分离。截断分子量(MWCO)
6、：为相当于一定截留率（通常为90%或95%）的相对分子质量。截留率越高，截断分子量的范围越窄的膜越好。膜分离装置的核心是 膜组件 。膜污染严重时会在膜表面形成 固体沉淀 。NF与RO、UF装置一样，其膜组件有4种形式，即卷式、中空纤维式、板框式和管式。NF膜介于有孔膜和无孔膜之间，同时又是 非对称 膜，除了浓差极化、膜面吸附、粒子沉积等污染因素外，溶质与膜面之间的 静电效应 也会对纳滤过程的污染产生影响，这是NF污染与UF，RO污染的重要区别。NF膜污染的控制方法可分为四种。一是 膜清洗 ，二是改变进料的部分物理化学性质 ，三是 改变操作方式 ，四是改性膜表面。膜亲和过滤法是一项新兴的技术，兼
7、有 膜分离 和 亲和色谱 的优点，具有处理量大、选择性强、易于放大等显著优点，可有效地进行生物产品的分离和纯化。亲和膜的分离过程包括： 分离膜的改性 ；亲和膜制备； 亲和络合 ；洗脱；亲和膜再生。亲和膜过滤的特点是同时体现了亲和色谱中生物特异性吸附及膜分离可大规模操作的优点，将 亲和载体 分散在溶液中进行吸附，避免了固定床操作带来的种种缺点。渗透蒸发区别于其它膜过程的重要特点是发生相变 ，在工业化可在相当大的范围内替代 精馏 。工业上萃取操作包括三个过程，即混合、分离和溶剂回收，因此萃取流程中必须包括混合器、分离器和回收器。对各种萃取操作过程进行计算时，须符合两个假定： 萃取相和萃余相 很快达
8、到平衡，即每一级都是理论级；两相完全不互溶，在 分离器 中能完全分离。工业上常用 HLB 数来表示表面活性剂的亲水与亲油程度的相对强弱，HLB 数越大，亲水性 越强，形成 O / W 型乳状液；HLB 数越小， 亲油性 越强，形成 W / O 型乳状液。最有效的去乳化方法是采用预处理手段，将发酵液中表面活性物质（蛋白质）除去，预先消除水相乳化。反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统， 表面活性剂 是反胶束溶液形成的关键。将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶束时，与AOT不同，还需加入一定量的助溶剂（助表面活性剂），这是由于 结构差异 所致。蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包括表面活性
9、剂与蛋白质的 静电作用力和位阻效应 。单一反胶束体系是由一种表面活性剂形成的最简单的反胶束体系。目前最常见的是AOT/异辛烷体系，结构简单，反胶束体积较大，适用于等电点较高、相对分子质量较小的蛋白质分离。水相的pH值决定了蛋白质表面电荷的状态，对于 阳离子 表面活性剂，溶液的pH pI时，反胶束萃取才能进行；对于 阴离子 表面活性剂，溶液的pH pl时，反胶束萃取才能进行。对于阴离子表面活性剂，当pHpl时，萃取率几乎为零，当pHpl时萃取率急剧提高。22、发酵液乳化现象是如何产生的？对分离纯化产生何影响? 如何有效消除乳化现象？答： 1、乳化现象是一种液体以极微小液滴均匀地分散在互不相容的另
10、一种液体中而产生的。 2、在液液萃取过程中两相界面产的生乳化现象，对萃取过程的进行是不利的。即使采用离心机也很难将两相完全分离，若萃取废液中夹带溶剂，收率会相应降低，经萃取的溶剂中夹带发酵液也会给以后的精制造成困难。 3、消除乳化现象方法有：过滤或离心分离、化学法、物理法、顶转法。最好采用预处理手段，将发酵液中的表面活性物质除去，消除水相乳化的起因。24、影响反胶束萃取蛋白质的因素有哪些？答：蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关，所以任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。影响反胶束萃取蛋白质的主要因素，见下表
11、，只要通过对这些因素进行系统的研究，确定最佳操作条件，就可得到合适的目标蛋白质萃取率，从而达到分离纯化的目的。25、 什么是沉淀法，具体包括哪些方法？ 答：1）利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。2）根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）复合盐沉淀法等；（7）亲和沉淀法；（8）选择性沉淀法。26、盐析的机理是什么？ 答：（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至
12、消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。27、影响盐析的因素有哪些？答：（1）pH值：一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液pH值调到目的蛋白的等电点处。 （2）在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质溶解度随温度上升而下降。（3） 沉淀蛋白
13、质盐的浓度和起始浓度有关。高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。28、有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？答、（1）降低溶剂介电常数（介电常数D有机 D水） ，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。（2）破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。（
14、3）相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。30、简述HIC的工作原理？答：HIC，疏水作用色层分离法，利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法。用碳链长度依次变化的同系列的烷基琼脂糖SephCn(n=1-6)分别装柱，在相同条下将混合蛋白质溶液通入柱中，不同蛋白质将在烷基琼脂系列柱中显示不同吸附特性，蛋白质的分辨能力取决于碳链的长度，因此可利用系列柱实验来调节己知蛋白质的吸附强弱，然后用缓冲液进行洗脱。 31、简述凝胶电泳的原理答：在凝胶电泳过程中，不同分子量的电荷溶质在迁移过程中的泳动速度是不同的。相对分子量较大的溶质受凝胶阻滞作
15、用较大，泳动速度慢；分子量小的溶质泳动速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条不同溶质的区带，实现溶质间的分离。凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度根据待分离料液中溶质的相对分子量而异。凝胶电泳的特点是凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一。32、 常用的凝胶电泳技术有哪些？答：根据凝胶电泳的支持介质，分为聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。（1）聚丙烯酰胺凝胶： 由丙烯酰胺和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成；（2）琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1,3连接的-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水-D吡喃半乳糖交替形成的。3
16、3、聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程答、（1）制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶；（2）样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度（12mg/L，考染），加样（溴酚蓝）；（3）电泳：46小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部；（4）检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色灵敏度比考染高100倍、荧光探针）；（5）照相、凝胶干燥；（6）定量测定。34、SDS-PAGE电泳的基本原理及过程答：（1）原理：SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、
17、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。35、等电聚焦及其特点答：等电聚焦：利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 特点：A、受溶质扩散影响小，IEF可消除分子扩散引起的分离度下降。B、两性电解质的加入对产品产生污染；C、pH梯度稳定性不高；D、操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象。36简述凝胶电泳和凝胶过滤层析的主要区别及其原因。答：凝胶过滤层析中每一个凝胶珠相当于一个分子筛，故小分子所经过的路径长，落在大分子后面；而凝胶电泳中整块胶板相当于一个分子筛，利用分离物所带的电荷多少不一样，电泳速度不一样，来分离的，故大分子受到的阻力大而迁移慢，落在小分子后面。
