1、课题1 果酒和果醋的制作一、实验原理1酵母菌的细胞呼吸：属于兼性厌氧微生物（真核生物）酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，表达式为：C6H12O6+O2CO2+H2O酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，表达式为：C6H12O6C2H5OH+CO22酵母菌发酵的最佳环境在葡萄酒的发酵过程中，其主要作用的是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。在发酵过程中，随着酒精度数的提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈深红色。在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。20左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵的最佳温度是在1825。3醋酸菌好氧性细菌（原核生物），只有
2、当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。在变酸的酒的表面观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖而形成的。当缺少糖源时和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸。表达式为：C2H5OHCH3COOH+H2O；当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。醋酸菌生长的最佳温度是在3035二、实验步骤1、材料的选择和处理：选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄冲洗，后除去枝梗。（原因：避免除去枝梗时，引起葡萄皮破损，增加被杂菌污染的机会。且不能反复冲洗。原因：避免菌种流失。）2、防止发酵液被污染：（1）榨汁机要清洗干
3、净，并晾干（2）发酵瓶要清洗干净，用体积分数为70%的酒精消毒或用洗洁精洗涤。（3）装入葡萄汁后，封闭充气口。3、控制好发酵条件：（1）葡萄汁装入发酵瓶时，要留有1/3的空间。(原因：保证酵母菌有氧呼吸大量繁殖和防止发酵液溢出)。（2）在制作葡萄酒的过程中严格控制发酵温度（1825）和时间（10d12d）。并可通过出料口对发酵液的情况进行及时的监测。（3）在制作葡萄醋（好氧性细菌）的过程中，温度控制在（3035 ），时间（7-8天左右）适时向发酵液中充气。三、注意问题：1、由于发酵旺盛期CO2的产量非常大，因此需要及时排气，防止发酵瓶爆裂。如果使用简易的发酵装置，如瓶子（最好选用塑料瓶），每天
4、要拧松（注意不是打开）瓶盖24次，进行排气。此后再将瓶盖拧紧。2、10 d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工作。3、当果酒制成以后，可以在发酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后将装置转移至3035 的条件下发酵，适时向发酵液中充气。如果没有充气装置，可以将瓶盖打开，在瓶口盖上纱布，以减少空气中尘土等的污染。4、酒精的检测：在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。（不需要加热）5、为了提高果酒的品质，更好的抑制其他微生物的生长，可以直接在果汁中加入人工培养的酵母菌。四、注意事项请分析此装置中的充气口、排气口和出料口分别有哪些作用。为什么排气口要通过一
5、个长而弯曲的胶管与瓶身连接？结合果酒、果醋的制作原理，你认为应该如何使用这个发酵装置？答：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。课题2 腐乳的制作一、 实验原理1参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉。（均是真核）2毛霉是一种丝状真菌，常见于土壤、水果、蔬菜、谷物上，具有发达的白色菌丝。3.毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨
6、基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。在多种微生物的协同作用下，普通的豆腐转变成风味独特的腐乳。二、实验步骤毛霉的生长：1.将豆腐切成3cm3cm1cm的若干块。所用豆腐的含水量为70左右，水分过多则腐乳不易成形。2.将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用。每块豆腐等距离排放，周围留有一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，以免湿度太高，不利于毛霉的生长。 3.将平盘放入温度保持在1518的地方。毛霉逐渐生长，大约5d后豆腐表面丛生着直立菌丝。问题： 菌种的来源：豆腐块上的毛霉来自空气中的毛霉孢子，而现代腐乳的生产是在严
7、格无菌的条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品的质量。 吃腐乳时，腐乳外面为什么会有一层皮？皮是前期发酵时在豆腐表面生长的菌丝（匍匐菌丝），它能形成腐乳的体，使腐乳成形，对人体无害。 豆腐上长白毛：毛霉的菌丝，直立菌丝。（还有匍匐菌丝）：1、 将长满毛霉的豆腐块（以下称毛坯）放入瓶中，同时逐层加盐。豆腐与盐的质量分数比为51。2、 随着豆腐层数的加高要增加食盐的用量，接近瓶口表面盐要铺厚一些。以防止杂菌从瓶口进入。约腌制8d。 问题：食盐的作用食盐能析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，在后期的制作过程中不会过早酥烂，同时盐还能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变
8、质。用盐腌制时，注意盐都用量。盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。1、卤汤的成分：酒和各种香辛料配制而成，酒的含量一般控制在12%，酒的作用：可以抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味。香辛料的作用（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）：调制腐乳的风味，防腐杀菌的作用。注酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败。三、注意问题：（1）控制好材料的用量（盐和酒的用量）（2）防止杂菌污染1、用来腌制的玻璃瓶，洗刷干
9、净后要用沸水消毒。2、装瓶时，操作要迅速小心。加入卤汤后，要用胶条密封瓶口，封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。四、注意事项1.酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐（白坯）上的生长。发酵的温度为1518，此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。毛霉生长大约5d后使白坯变成毛坯。前期发酵的作用，一是使豆腐表面有一层菌膜包住，形成腐乳的“体”；二是毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶，有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料（红曲、面曲、酒酿），使
10、蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。2.毛霉是一种低等丝状真菌，有多个细胞核，进行无性繁殖。毛霉是食品加工业中的重要微生物，它可以产生能够分解大豆蛋白的蛋白酶，常用于制作腐乳和豆豉。课题3 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量一、乳酸菌发酵： 泡菜的制作离不开乳酸菌，乳酸菌种类很多，它是厌氧细菌，在无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸。常见的有乳酸链球菌和乳酸杆菌。问题：含有抗生素的牛奶能不能发酵成酸奶？抗生素能杀死或抑制乳酸菌的生长，因此不能。二、亚硝酸盐：白色粉末，易溶于水。膳食中的烟硝酸盐一般不会危害人体健康。膳食中的大部分亚硝酸盐在人体内以“过客”的形式随尿液排出，只有在特定条件下（适宜
11、的PH、温度和一定的微生物作用）才会变成致癌物亚硝胺。问题：为什么不宜多吃腌制蔬菜？腌制的过程中，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。三、实验设计：泡菜的制作：按照清水和食盐的质量比为4:1的比例配制盐水，将盐水煮沸（除去水中的氧气、杀死杂菌）冷却。将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛内，装至半坛时，放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满，再注入盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。向坛盖边沿的水槽注满水，（以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境）。要经常补水，发酵时间长短受室内温度影响。问题：为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这是什么？白膜是产膜酵母的大量繁殖。酵母菌属于
12、兼性厌氧微生物，泡菜坛发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖。：比色法在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。四、注意问题：1、 2、腌制过程中，要注意控制腌制的时间、温度、和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量开始增加。一般在腌制10天后，亚硝酸盐含量开始下降。3、 泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化发酵时期乳酸菌乳酸亚硝酸盐发酵初期少（有氧气）少增加发酵中期最多积累、增多、PH下降下降发酵后期减少增多下降到相对稳定课题1 微生物的实验室培养一、培养基人
13、们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。培养基按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是
14、用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、N
15、H4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件二、无菌技术获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与
16、周围的物品相接触。无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ；培养基
17、、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能制作牛肉膏蛋白胨固体培养基方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（先调PH，后灭菌）倒平板操作的讨论1.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。2、平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培
18、养基，造成污染。3、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂
19、布平板操作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5）平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。灼烧接种环，待其冷却后，从第 一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最 后一区的划线与第一区相连。将平板倒置
20、放入培养箱中培养。平板划线操作的讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线
21、操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（6）涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作的讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要
22、接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在恒温箱中保温12天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）选择性培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（3）配制选择培养基的
23、依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统
24、计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。采用此方法的注意事项： 一般选取菌落数在30300之间的平板进行计数设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH7的土壤中取样。铲
25、去表层土，在距地表约38cm的土壤层取样。（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106测定放线菌的数量，一般选用103 104 105 测定真菌的数量，一般选用102 103 104（3）微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌3037 12天放线菌2528 57天 霉菌2528 34天每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落
26、的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色疑难解答（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数。课题三 分解纤维素的微生物的分离一、纤维素与纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄
27、糖。二、纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。三、分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）梯度稀释将
28、样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落（1）土壤采集 选择富含纤维素的环境。（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板（3）刚果红染色法种类一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。课题延伸对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。疑难解答（1）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？由于生物与环境
29、的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。（2）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。专题三 植物的组织培养技术课题一 菊花的组织培养一、植物组织培养的基本过程原理：细胞的全能性二、影响植物组织培养的条件1、材料的种类：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未
30、开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。2、适宜的营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。3、植物激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物
31、激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。使用顺序实验结果先生长素，后细胞分裂素有利于分裂但不分化先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高生长素 细胞分裂素比值与结果比值高时促根分化，抑芽形成比值低时促芽分化，抑根形成比值适中促进愈伤组织生长 +4、环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在1822，并且每日用日光灯照射12h. 三、 操作流程1、配制MS固体培养基在菊花组织培养中，可以不添加植物激素原因是菊花茎段组织培养比较容易。灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。微生物培
32、养基以有机营养为主，MS培养基则需提供大量无机营养。2、外植体的消毒 3、接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上（不要倒插），每个锥形瓶接种78个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。4、培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（1822）和光照（12h）5、移栽6、栽培 外植体在培养过程中可能会被污染，原因：外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。专题二 月季的花药培养一、被子植物的花粉发育：花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期
33、和双核期等阶段。在小孢子四分体时期，4个单倍体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的4个单倍体细胞彼此分离，形成4个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核居中期）。随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂成1个生殖细胞核和1个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。生殖细胞将在分裂一次，形成两个精子。二、产生花粉植株的两种途径：通过花药培养产生花粉植株（即单倍体植株）一般有两种途径，一种是花粉通过胚状体阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没有绝对的界限，主要
34、取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。注意：无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根三、影响花药培养的因素：诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素。亲本的生理状况：选择月季的初花期。合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。花蕾：选择完全未开放的花蕾亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙
35、花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色四、材料的消毒五、接种和培养：灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成，通常每瓶接种花药710个,培养温度控制在25左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般经过2030天培养后,会发现花药开裂,长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分
36、开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。还需要对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛选。植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。专题六植物有效成分的提取 课题一植物芳香油的提取一、天然香料的来源：植物、动物不同植物的根、茎、叶、花、果实、种子都可以提取芳香油。二、芳香油的提取方法：蒸馏、压榨、萃取等。芳香油的性质：挥发性强，成分复杂，难溶于水、化学
37、性质稳定。以萜类化合物及其衍生物为主。水蒸气蒸馏法：原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。方法：水中蒸馏、水上蒸馏、水汽蒸馏。不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。通常用压榨法。萃取法：原理：芳香油易溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质蒸馏装置的安装：仪器一般都按照自下而上、从左到右的顺序。拆卸仪器的顺序与安装时相反。三、玫瑰精油的提取：水蒸气蒸馏法0.1g/mL氯化钠溶液：促使油水混合物（乳浊液）中油和水的分离。无水硫酸钠：吸收油层中的水分。装入蒸馏原料：称取5
38、0g玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL蒸馏水。（玫瑰花与清水比例1:4）分离油层：向乳浊液加入NaCl溶液后，利用分液漏斗分离出上面的油层。除去水分：向油层中加入无水硫酸钠，24h后过滤，得到玫瑰油。注意事项：蒸馏时间不能过短，温度不能过高。四、橘皮精油的提取：压榨法橘皮精油的主要成分：柠檬烯，主要分布在橘皮中。石灰水：能够破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。碳酸氢钠、硫酸钠：促进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的0.25和5）。实验步骤：橘皮的处理：将新鲜橘皮用清水清洗沥干。石灰水浸泡：用78石灰水浸泡橘皮10h以上，清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。粉碎和压
39、榨：将橘皮粉碎，加入小苏打和硫酸钠后，用压榨机压榨得到压榨液。过滤压榨液：用布袋过滤，滤液再高速离心处理，分离出上层橘皮油。静置处理：将橘皮油在510冰箱中静置57d，分离出上层澄清橘皮油。再次过滤：将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油。分析：静置处理目的：除去果蜡和水分。课题二胡萝卜素的提取一、基础知识：胡萝卜素性质：橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。提取胡萝卜素的方法主要有三种：从植物中提取从大面积养殖的岩藻中获得利用微生物的发酵生产二、实验步骤粉碎：使原料与有机溶剂充分接触，增大溶解度。干燥：脱水温度太高，干燥时间太长会导致
40、胡萝卜素分解。、萃取剂的选择水溶性的：乙醇、丙酮水不溶性的：石油醚、乙酸乙酯、 乙醚、苯、四氯化碳等选择：具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。、影响萃取的因素主要因素：萃取剂的性质和使用量次要因素：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。萃取前，要将胡萝卜进行粉碎和干燥、胡萝卜素提取装置的设计：萃取过程应该避免明火加热，采用水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸。为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。鉴定方法：纸层析法乙醇和丙酮能够用于胡萝卜素的萃取吗？为什么？答：胡萝卜素可溶于乙醇和丙酮，但它们是水溶性有机溶剂，因萃取中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它们作萃取剂。2.在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳这几种有机溶剂中，哪种最适宜用来提取胡萝卜素？答：在这五种有机溶剂中，石油醚的沸点最高，在加热萃取时不易挥发，所以石油醚最适宜用作萃取剂。
