1、ABO ABO 血型的基因型检测血型的基因型检测一、实验目的与原理实验目的与原理1.目的n了解ABO血型的遗传学原理n掌握在DNA水平上鉴定ABO基因型的基本原理和操作过程2.原理nABO 血型抗原是由 I A ;IB;i 基因编码的特异性糖基转移酶催化合成的红细胞膜表面的糖蛋白和糖脂。nABO 基因座位位于第九号染色体上,其3 个等位基因I A 、IB、i 形成4 种主要的血型A、B、AB 和O。nABO血型系统遗传方式 A血型：IA I A;IAi B血型：I BIB;IBi AB血型：IAIBO血型：iinIA基因与IB基因之间在cDNA上有7个单碱基替换：A294G、C523G、C65
2、4T、G700A、C793A、G800C和G927A。n i基因与IA基因相比只是cDNA的第258位的胞嘧啶缺失，出现框移突变，使第352位的1-rA变成了TAA(终止密码子)，提前终止了转移酶的合成，导致合成的转移酶没有活性区，所以在红细胞膜上没有，抗原的产生。根据genebank上公布的I A、IB、i 基因序列设计引物，扩增ABO糖基转移酶基因中的2个区段。引物由上海生工合成，引物序列为：l引物1：5-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3l引物2：5-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3l引物3：5-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3l引物4：5-CACCG
3、ACCCCCCGAAGAA-3l用1、2引物进行PCR扩增，等位基因IA，IB产物为200bp，等位基因i(258位G缺失)产物为199bp。l限制性内切酶kpn I：i基因PCR产物 199bp 切出171bp28bp，IA，IB基因PCR产物 200bp没有该酶的切点依然是200bp。l用3、4引物进行PCR扩增，等位基因I A、IB、i的产物均为159bp。l限制性内切酶Alu I：IB 基因PCR产物 159bp 切出118bp41bp，I A、i基因PCR产物 159bp没有该酶的切点依然是159bp kpnI（1，2引物产物）消化：nA，B基因 200bp：200nO基因 199b
4、p:171 28Alu I消化(3,4引物产物):nA，O基因 159bp：159nB基因 159bp:118 411，2引物产物引物产物 kpnI 3,4引物产物引物产物 Alun IA 200159B 200118+41O171+28159二、实验用品二、实验用品nPCR扩增仪、扩增仪、电泳仪和电泳槽、微型移液器、恒电泳仪和电泳槽、微型移液器、恒温水浴锅温水浴锅、凝胶成像系统等，离心管、凝胶成像系统等，离心管、PCR管、管、移液器枪头等移液器枪头等n蛋白酶蛋白酶K、Triton X-100、TKM液液、10%SDS、DTT、饱和饱和NaCl、95%冰乙醇、冰乙醇、TE缓冲液、缓冲液、10P
5、CR buffer、Taq DNA Polymerase、10Easy Taq DNA Polymerase Buffer、dNTP、Kpn、10Buffer Kpn（with BSA）、）、Alu、10BufferAlu（with BSA）、）、DNA Marker三、实验内容与操作三、实验内容与操作n1.材料准备：材料准备：n 收集志愿者带有毛囊的头发收集志愿者带有毛囊的头发67根，用无水乙醇根，用无水乙醇清洗、蒸馏水漂洗后，自然风干待用。清洗、蒸馏水漂洗后，自然风干待用。n每根头发取毛根每根头发取毛根0.5cm，剪为两段，分别放入至，剪为两段，分别放入至0.2mL 离心管中（每管中的头发
6、均取自同一个离心管中（每管中的头发均取自同一个体）。体）。n2.DNA提取：提取：DTT-TKM-TritonX-100抽提法抽提法n每管样品加入每管样品加入200L TKM200L TKM液，混匀，加液，混匀，加1 1滴滴TritonX-100TritonX-100，混匀，混匀，6000r/min6000r/min离心离心5min 5min，弃上清。，弃上清。n将沉淀溶于将沉淀溶于40L TKM40L TKM液，加液，加3L 10%SDS3L 10%SDS，4L4L蛋白酶蛋白酶K K（0.2 g/L0.2 g/L），），8L DTT8L DTT（4 mol/L4 mol/L），剧烈混匀，），
7、剧烈混匀，55 55 水水浴浴5min5min。n加入加入15L15L饱和饱和NaClNaCl（6 mol/L6 mol/L），混匀，），混匀，13000r/min13000r/min离心离心5min5min。n转移上清约转移上清约40L40L至另一管中，加至另一管中，加2.52.5倍体积倍体积95%95%冰乙醇，冰乙醇，-2020，30min30min。n13000r/min13000r/min离心离心10min10min，弃上清，加，弃上清，加75%75%冰乙醇洗冰乙醇洗1 1 次，干次，干燥，溶于燥，溶于100L TE100L TE，-20-20保存。保存。3.扩增反应扩增反应：n扩增程序：1.94预预变性5min 2.94变性50s，3.60退火30s，4.72延伸60s，5.72延伸10min 6.4保温。35次循环次循环n4.酶切反应：酶切反应：置37酶切反应3h，65 10min终止反应。n5.电泳检测：将酶切产物在3的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后观察结果并照相。四、注意事项四、注意事项 五、作业与思考题五、作业与思考题n给出实验结果并进行分析
