1、第六章环境化学物的特殊毒性及其评价遗传毒性第六章环境化学物的特殊毒性及其评价遗传毒性一般毒性和特殊毒性一般毒性和特殊毒性u 急性毒性急性毒性u亚慢性毒性亚慢性毒性u慢性毒性慢性毒性u蓄积毒性蓄积毒性u 局部毒性局部毒性n致突变作用致突变作用n 致癌作用致癌作用n生殖和发育毒性生殖和发育毒性一般毒性一般毒性特殊毒性特殊毒性安全性评价安全性评价3.3.污染物致突变作用机理污染物致突变作用机理 4.4.污染物致突变的不良后果污染物致突变的不良后果5.5.污染物致突变作用的评价污染物致突变作用的评价2.2.遗传损伤的类型遗传损伤的类型第一节第一节 环境化学物的致突变性及其评价环境化学物的致突变性及其评
2、价小鼠骨髓细胞微核实验小鼠骨髓细胞微核实验环境毒理学环境毒理学实验实验 1.1.引言引言 突变(mutation)是一种遗传状态、可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。遗传变异1.父、母DNA重组2.基因突变3.染色体组成或细胞质变化突变自发突变诱发突变1.1.引言引言1.1 1.1 环境致突变作用环境致突变作用(environmental mutagenesis)化学物质及其他环境因素导致生物体遗传机构的改变，可以导致人类的某些遗传性疾病且与癌症的发生有关1.1.引言引言自发突变自发突变(spontaneous mutation)：自然条件下发生，概率极低，生物进化的基础诱发突变诱
3、发突变(induced mutation)：人为地或由各种因素诱发产生化学因素化学因素环境致突变作用环境致突变作用物理因素物理因素生物因素生物因素1.1.引言引言时间时间事件事件作者作者1904发现发现X射线可以改变生殖细胞的遗传物质射线可以改变生殖细胞的遗传物质de Vries一些氧化剂对细菌和真菌诱变作用的研究一些氧化剂对细菌和真菌诱变作用的研究Franz&Elizabeth1927用用X射线照射发现可以引起果蝇基因突变射线照射发现可以引起果蝇基因突变Mller1942发现芥子气可诱发果蝇基因和染色体畸变发现芥子气可诱发果蝇基因和染色体畸变Charlotte&Robson1943发现氨基甲
4、酸乙酯有诱变性发现氨基甲酸乙酯有诱变性Franzoechlkers1946-48发现环氧乙烷、乙烯亚胺、重氮甲烷、缩水发现环氧乙烷、乙烯亚胺、重氮甲烷、缩水甘油等具有诱变性甘油等具有诱变性Rapoport1969成立国际环境诱变剂学会成立国际环境诱变剂学会1.2 1.2 环境致突变作用研究简史环境致突变作用研究简史遗传毒理学遗传毒理学(Genetic Toxicology)(Genetic Toxicology)化学性和放射性因素的致突变作用和机理、对人类接触致突变物引起的健康效应和预防措施的科学。研究内容1.潜在的致突变作用2.致突变作用机制3.建立新的检测方法4.评价致突变物对人类健康的威
5、胁1.1.引言引言1.3 1.3 环境致突变剂环境致突变剂 (Environmental Mutagen）分组分组特点特点类别类别第一组 人工合成，仅在一定条件下应用的诱变剂1.药品：抗癌药、抗菌素、麻醉剂和避孕药等2.农药：杀虫剂、灭鼠剂、除锈剂、除霉剂及其残留物3.食品添加剂4.化妆品5.生物污染 第二组 工业生产中应用或生产的环境诱变剂1.工业烷化剂2.有机溶剂及有机金属化合物3.水体污染物4.空气污染物 5.重金属及其化合物第三组 自然诱变剂与食品加工过程中产生的诱变剂1.生物碱2.微生物代谢产物3.食品加工中产生的诱变剂-9-2.2.遗传损伤的类型遗传损伤的类型机制以DNA为靶不以D
6、NA为靶基因突变染色体结构畸变染色体数目畸变细胞水平分子水平损伤牵涉范围显微镜可见度基因突变染色体突变基因组突变碱基置换移码突变大段损伤染色体数目畸变染色体结构畸变DNA链中正常的碱基配对链中正常的碱基配对A:腺嘌呤 T:胸腺嘧啶 C:胞嘧啶 G:鸟嘌呤A:腺嘌呤 T:胸腺嘧啶 G:鸟嘌呤 C:胞嘧啶2.2.遗传损伤的类型遗传损伤的类型2.1 2.1 基因突变基因突变基因突变基因突变(gene mutation)：基因中DNA序列的改变，又称为点突变。碱基置换碱基置换转换转换 A G T C颠换颠换 A or G C or T 同义突变同义突变：未改变基因产物氨基酸序列错义突变错义突变：引起产
7、物氨基酸序列改变无义突变无义突变：使蛋白质合成中止2.1 2.1 基因突变基因突变移码突变移码突变：从mRNA到蛋白质翻译过程中遗传密码子读码顺序的突变。使基因产物发生大的改变，引起明显的表型效应，常导致致死性突变大段损伤大段损伤：DNA序列上有较长的一段序列的重排分布，也叫DNA重排。2.1 2.1 基因突变基因突变2.2 2.2 染色体突变染色体突变染色体突变染色体突变(chromosomal mutation)：染色体结构的改变，又称为染色体畸变。断裂剂断裂剂(clastogen)：能引起染色体畸变的外源化学物。染色单体型畸变染色单体型畸变染色体型畸变染色体型畸变a a染色单体断裂染色单
8、体断裂 b b三辐射体三辐射体 c.c.染色体断片染色体断片 d.d.双着丝点染色体双着丝点染色体 e.e.环状染色体环状染色体 f-g.f-g.无着丝点断片无着丝点断片 2.2 2.2 染色体突变染色体突变2.3 2.3 基因组突变基因组突变基因组突变基因组突变(genomic mutation)：基因组中染色体数目的改变，又称为染色体数目畸变。类型类型公式公式染色体组染色体组整倍体整倍体单倍体单倍体二倍体二倍体三倍体三倍体四倍体四倍体非整倍体非整倍体单体单体三体三体四体四体双三体双三体缺体缺体n2n3n4n2n-12n+12n+22n+1+12n-2(ABCD)(ABCD)(ABCD)(A
9、BCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABC)(ABCD)(ABCD)(A)(ABCD)(ABCD)(AA)(ABCD)(ABCD)(AB)(ABC)(ABC)(1)(1)大加合物大加合物 代表物：多环芳烃、生物毒素、黄曲霉毒素代表物：多环芳烃、生物毒素、黄曲霉毒素B B和芳香胺类和芳香胺类 后后 果：果：DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位的立体构象发生明显变化，阻断受损部位DNADNA的半的半保留复制和转录。保留复制和转录。2.2.化合物的致突变机理化合物的致突变机理2.1 2.1 DNADNA加合物和交联分子的形成加合物和交联
10、分子的形成 苯并(a)芘芳香胺黄曲霉毒素B(2)(2)小加合物小加合物 代表物：烷化剂、亚硝基化合物代表物：烷化剂、亚硝基化合物 后后 果：对果：对DNA的构象影响较小，易导致碱基错误配对。的构象影响较小，易导致碱基错误配对。DNA甲基化、乙基化甲基化、乙基化2.1 2.1 DNADNA加合物和交联分子的形成加合物和交联分子的形成 (3)DNA-DNA交联：DNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接.代表物：如亚硝酸、丝裂霉素C、氮和硫的芥子气、各种铂的衍生物 后 果：DNA在复制中不能解链，螺旋局部形成，DNA复制和转录完全停止，细胞死亡丝裂霉素C碱基类似物：与天然碱基的结构非
11、常相似的外源化合物 后 果：引发碱基替代突变2.2 2.2 碱基类似物在碱基类似物在DNADNA复制时的掺入复制时的掺入 亚硝基引起的氧化脱氨反应亚硝基引起的氧化脱氨反应 NH2OH的致突变作用的致突变作用 作用机制复杂，不同作用机制复杂，不同PHPH、NH2OH浓度，产浓度，产物不同物不同 烷化剂的致突变作用烷化剂的致突变作用 硫酸二甲酯、甲基磺酸乙酯、乙基磺酸乙酯、硫酸二甲酯、甲基磺酸乙酯、乙基磺酸乙酯、MNNG2.3 DNA2.3 DNA分子上碱基的化学修饰分子上碱基的化学修饰 2.4 2.4 嵌合剂的致突变作用嵌合剂的致突变作用 原黄素原黄素丫啶橙丫啶橙代表物：丫啶橙、原黄素等丫啶类染
12、料分子方 式：以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸之间后 果：移码突变化合物的致突变机理化合物的致突变机理1.碱基损伤 致突变物改变或破坏碱基的正常结构。(1)碱基错配 (2)平面大分子嵌入DNA链 (3)碱基类似物取代 (4)碱基化学结构改变或破坏 2.DNA链结构损伤 (1)形成嘧啶二聚体 (2)形成DNA加合物和DNA蛋白质交联物3.影响细胞分裂过程4.对修复酶的影响激活原癌基因或灭活抑癌基因激活原癌基因或灭活抑癌基因化学、物理、生物因素化学、物理、生物因素 原癌基因点突变 原癌基因扩增 染色体易位与基因重排 原癌基因抑制解除 抑癌基因缺失原癌基因原癌基因
13、抑癌基因抑癌基因癌基因癌基因致突变因素机体对突变的修复DNA修复直接修复切除修复O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶二聚体光解酶错配碱基修复碱基切除修复核苷酸切除修复复制后修复呼救性修复嘌呤插入酶DNA连接酶遗传毒性的后果及其形成机制遗传毒性的后果及其形成机制致突变作用致突变作用生殖细胞突变生殖细胞突变 显性显性致死致死隐性隐性致死致死存活存活突变突变动脉动脉硬化硬化未知未知疾病疾病癌癌变变老老化化出生缺陷出生缺陷(流产流产/死死胎胎)癌变癌变 出生缺陷出生缺陷(功能或结功能或结构畸形构畸形)流产流产死产死产 出生缺陷出生缺陷基因负荷基因负荷先天性疾病先天性疾病3.3.遗传毒性检测实验遗传毒性检测实验2
14、染色体畸变试验 哺乳动物细胞染色体畸变试验 微核试验 显性致死试验 小鼠遗传易位试验 3 DNA损伤与重组试验 细菌DNA修复试验 程序外DNA合成试验 姊妹染色单体交换(SCE)试验 SOS显色试验(SOS chromotest)1 基因突变试验 原核细胞微生物试验 真核微生物试验 昆虫试验 哺乳动物体细胞体外试验 小鼠基因突变试验3.1 3.1 原核细胞微生物试验原核细胞微生物试验(Ames试验试验)利用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株，根据受试物是否诱发沙门氏菌突变型(his)回复为野生型(his)的形成菌落的能力，测定受试物。正向突变正向突变回复突变回复突变野生型野生型his+突变型突
15、变型his 代谢活化系统(S-9mix)受试物受试物 AmesAmes试验方法试验方法沙门氏菌突沙门氏菌突变型变型(his)受试物受试物大鼠肝微粒大鼠肝微粒体酶体酶(S-9)顶层琼脂培养基顶层琼脂培养基混匀混匀37,48h低剂量低剂量中剂量中剂量高剂量高剂量对照组对照组AmesAmes试验标准菌株和敏感性试验标准菌株和敏感性标准菌株 TATA9797 移码突变 TATA9898 移码突变 TATA100100 碱基置换突变 TATA102 102 碱基置换突变、对醛类、过氧化物及DNA交链剂比较敏感脂多糖突变(rfa)增加细胞壁的通透性uvrB缺失 DNA损伤后修复力降低R因子 增高诱变率 哺
16、乳动物细胞（正向）突变试验哺乳动物细胞（正向）突变试验细胞株：小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)中国仓鼠肺细胞(V79)中国仓鼠卵巢(CHO)人成纤维细胞或淋巴细胞 哺乳动物细胞野生型BrDU死亡死亡哺乳动物细胞野生型BrDUBrDU正向突变受试物生长生长（抗药性）（抗药性）3.2 哺乳动物体细胞致突变体外试验哺乳动物体细胞致突变体外试验 3.3 3.3 染色体畸变试验染色体畸变试验 细胞受到诱变剂的作用后，染色体数目和较大范围的结构改变。在细胞分裂中期，利用光学显微镜下直接观察到这些变化。体外实验 中国仓鼠卵巢细胞 中国仓鼠肺细胞 外周血淋巴细胞体内实验 小鼠骨髓细胞染色体畸变试验 小鼠睾丸细胞
17、*细胞分裂周期原理原理染色体畸变试验方法染色体畸变试验方法急性试验 染毒一次亚急性试验 连续染毒5天慢性实验 连续染毒3个月淋巴细胞培养细胞中期相细胞受试物培养基染色体数目 结构秋水仙素阻止纺垂丝形成处死前2-4h 腹腔注射体外实验哺乳动物经口或腹腔注射骨髓，睾丸细胞体内实验染色体畸变染色体畸变染色体结构异常 裂隙、断裂、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点环等数目异常 多倍体或非整倍体3.43.4 微核试验微核试验 在致突变剂作用下，染色体损伤产生的无着丝点染色体断片和环，在细胞分列时不能定向移动进入细胞核，残留在细胞质中。微核的着色和细胞核相同，比正常细胞核小。本试验可以检测受试物的染色体断裂
18、作用和非整倍体诱变作用。微核试验方法微核试验方法腹腔注射受试物骨髓 嗜多染RBC微核出现率(1/1000)小鼠24h外周血淋巴细胞微核试验细胞培养微核试验植物细胞非哺乳类动物细胞3 3.5.5 显性致死试验显性致死试验雄鼠 连续染毒5天 从染毒第一天起经过一个精子发育周期（大鼠60天，小鼠35天）未交配过的雌鼠同笼5天妊娠1214天 剖腹检查活胎数、早死胎数、晚死胎数染毒后交配时期1w 输精管和附睾中的精子2w 精子后期3w 精子前期4w 精母细胞后期5w 精母细胞前期6w 精原细胞以小鼠为例3.6 3.6 姊妹染色单体交换试验（姊妹染色单体交换试验（SCE)SCE)SCE是指一个同源染色体内
19、，两个染色单体之间DNA复制产物发生互相交换，可能与染色体断裂和重接有关。判断受试物是否具有DNA损伤作用。SCESCE试验原理示意图试验原理示意图第一次细胞分裂BrDUBrDUBrDU掺入到新合成的DNA链第二次细胞分裂BrDU掺入到新合成的DNA链SCE交换交换BrDUBrDU遗传毒理学试验可信性评价遗传毒理学试验可信性评价 实验方法 灵敏性(%)特异性(%)准确性()AmesAmes试验 17/19(89%)3/10(30%)20/29(69%)骨髓细胞染色体畸 18/18(100%)2/10(20%)20/28(71%)变试验或微核试验 显性致死试验 18/18(100%)8/10(80%)26/28(93%)遗传毒性检测实验组合原则遗传毒性检测实验组合原则 1.应包括每一类型的遗传终点。应能检出基因突变、染色体断裂、重组作用、非整倍体或多倍体改变。Ames试验，微核试验，细菌DNA修复试验，SCE。2.应包括进化程度不同的物种。3.体内外实验配合。体外试验应有体外活化系统。4.应包括生殖细胞和体细胞。USEPAUSEPA遗传毒性评价试验程序遗传毒性评价试验程序特异座位试验形态学改变生物化学改变体内骨髓细胞遗传学试验 染色体畸变试验微核试验Ames 试验体外哺乳动物细胞基因突变试验与性腺DNA相互作用的试验显性致死试验可遗传易位试验第三阶段第二阶段第一阶段
