1、酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸教学目标教学目标:1、知道纤维素酶的种类及作用、知道纤维素酶的种类及作用2、初步掌握从土壤中分离出分解纤维、初步掌握从土壤中分离出分解纤维 素的微生物的实验方法素的微生物的实验方法酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸阅读课本阅读课本27页基础知识部分第一、二段，回答下列问题：页基础知识部分第一、二段，回答下列问题：1、纤维素在生物圈的分布状况？、纤维素在生物圈的分布状况？2、纤维素酶的组成及作用？、纤维素酶的组成及作用？纤维素纤维素(C6H10O5)n是地球上含量最丰富的多糖类物质。是地球上含量最丰富的多糖类物质。植物的根
2、、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即组分，即CX酶酶、C1酶酶和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶，前两种酶使，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。成葡萄糖。一、纤维素和纤维素酶一、纤维素和纤维素酶酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸纤维素纤维素纤维二糖纤维二糖葡萄糖葡萄糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖葡萄
3、糖苷苷酶酶草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？肠胃中的共生微生物。除自然环境中存在分解肠胃中的共生微生物。除自然环境中存在分解纤维素的微生物外，在草食性动物等的消化道纤维素的微生物外，在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。纤维素的能力。酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸 在在2支支20mL的试管中，分别放入的试管中，分别放入16cm的滤纸条，再分别加入的滤纸条，再分别加入pH为为4.8、物质的量、物质
4、的量浓度为浓度为0.1mol/L的醋酸的醋酸-醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液10mL、11mL。在加入。在加入10mL缓冲液的试管中加入缓冲液的试管中加入1mL纤维素酶（纤维素酶（7080U/mL）。将二支试管）。将二支试管固定在固定在50mL的锥形瓶中，在摇床上以的锥形瓶中，在摇床上以140r/min的转速振荡反应的转速振荡反应1h，观察结果。，观察结果。1U表示表示1个酶活力单位，是指在温度为个酶活力单位，是指在温度为25，其他反应条件，其他反应条件，如如pH等，均为最适的情况下，在等，均为最适的情况下，在1min内转化内转化1mmol的底物所的底物所需的酶量。需的酶量。底物：酶所作用和催化的化
5、合物。底物：酶所作用和催化的化合物。酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸二、纤维素分解菌的筛选二、纤维素分解菌的筛选 刚果红刚果红(Congo Red,简称简称RD)是一种染料，是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，
6、刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸回答下列问题：回答下列问题：1、纤维素分解菌的筛选方法、纤维素分解菌的筛选方法2、纤维素分解菌的筛选方法的原理、纤维素分解菌的筛选方法的原理刚果红染色法刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接：这种方法能够通过颜色反应直接 对微生物进行筛选对微生物进行筛选 刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色刚果红是
7、一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红当纤维素被纤维素酶分解后刚果红纤维素的复合纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的心的 。这样我们可以通过是否产生透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌来筛选纤维素分解菌透明圈透明圈 酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸刚果红染色法刚果红染色法方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚果先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应红进行
8、颜色反应方法二：方法二：在倒平板时就加入刚果红在倒平板时就加入刚果红思考：思考：这两种方法各有哪些优点与不足？这两种方法各有哪些优点与不足？酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸方法一：方法一：方法二：方法二：步步骤骤培养基经涂布培养长出菌落培养基经涂布培养长出菌落覆覆盖盖1mg/mL的的CR溶液溶液(1015min后后)倒去倒去CR溶液溶液加入加入1mol/L的的NaCl溶液溶液15min后倒掉后倒掉NaCl溶溶液液出现透明圈出现透明圈配置配置10mg/mL的的CR溶液溶液灭菌灭菌按按照照1mLCR溶液溶液/200mL培养基的比例培养基的比例混匀混匀倒平板倒平板接种后培养接种后培养出现透出现透
9、明圈明圈优优点点显示出的颜色基本上是纤维素分显示出的颜色基本上是纤维素分解菌的作用解菌的作用操作简便，不存在菌落的混杂问题操作简便，不存在菌落的混杂问题缺缺点点操作繁琐，加入刚果红会使菌落操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂之间发生混杂由于产生淀粉酶的微生物也形成透由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能产生假阳性反应。明圈，所以可能产生假阳性反应。有些微生物具有降解色素的能力，有些微生物具有降解色素的能力，他们在培养过程中也会形成明显的透他们在培养过程中也会形成明显的透明圈，与纤维素的分解菌不易区分。明圈，与纤维素的分解菌不易区分。两种刚果红染色法的比较：两种刚果红染色法的比较：酶酶
10、筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红合上去了，氯化钠溶液就可以使结合
11、不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！当然分解纤维素的能就强！酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸练一练：练一练：1、下列关于纤维素酶的说法，错误的是、下列关于纤维素酶的说法，错误的是A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，、利用刚果红法
12、可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是下列说法错误的是A、刚果红能与纤维素形成红色复合物、刚果红能与纤维素形成红色复合物 B、刚果红能与纤维二糖形成红色复合物、刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C、刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物、刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D、若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出、若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌了纤维素分解菌酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸三、实验操作三、实验操作土壤取样土壤取样选择培养选择培养*梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上素分解菌的培养基上挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌
13、落酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸土壤取样土壤取样取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？选择纤维素丰富的环境，如树林中多选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。叶等等。生物与环境的互相依存关系，在富含生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境的几率要高于普通环境酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸 为什么要在富含纤
14、维素的环境中寻找纤维素为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？分解菌？将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？应该埋进土壤多深？由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋
15、于深约人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右的腐殖土壤中。左右的腐殖土壤中。酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸选择培养选择培养培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水酶酶筛选筛选操
16、作操作结果结果延伸延伸1、选择培养的目的：、选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物所需要的微生物2、制备选择培养基、制备选择培养基参照课本参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题页旁栏中的比例配置，回答下列问题a、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具 有，是有，是如何进行选择的？如何进行选择的？c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计
17、一个对照实验，说明选择培养基的作用是液体培养基，原因是配方中无凝固剂是液体培养基，原因是配方中无凝固剂有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的分解纤维素的 微生物可以大量繁殖微生物可以大量繁殖用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照选择培养选择培养酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸3、操作方法：、操作方法：将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养直至培养
18、液变浑浊。也可重复选择培养思考：思考：为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到制，因此可以起到“浓缩浓缩”的作用的作用酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸梯度稀释梯度稀释 按照课题按照课题1的稀释操作方法，将选择培的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到到1
19、06酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸将样品涂布到鉴别纤维将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上素分解菌的培养基上1、制备培养基、制备培养基:参照旁栏中的比例参照旁栏中的比例2、涂布平板：将稀释度为、涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液的菌悬液各取各取0.1ml涂布在培养基上，涂布在培养基上，30倒置培养倒置培养酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 1
20、5g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸上述物质溶解后，加蒸馏水定容至馏水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸挑选产生透挑选产生透明圈的菌落明圈的菌落 参照课本参照课本刚果红染色法刚果红染色法，挑选产生透，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸练一练练一练1、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（学观点
21、？（）A、生物结构与功能相适应的观点、生物结构与功能相适应的观点 B、生物结构与功能整体性观点、生物结构与功能整体性观点C、生物与环境相适应的观点、生物与环境相适应的观点 D、生物发展进化的观点、生物发展进化的观点2、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（）土壤取样土壤取样 梯度稀释梯度稀释 选择培养选择培养 菌悬液涂布平板菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落挑选出单个菌落A、B、C、D、3、有关选择培养正确的叙述是（、有关选择培养正确的叙述是（）A、可以增加纤维素分解菌的浓度、可以增加纤维素分解菌的浓度B、可以减少纤维素分解菌的浓度、可以减少纤维素分解菌的浓度C
22、、所用培养基是固体培养基、所用培养基是固体培养基D、所用培养基是平板培养基、所用培养基是平板培养基CBA酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸四、结果分析与评价四、结果分析与评价培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸五、课题延伸五、课题延伸 本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。的测定。酶酶筛选筛选操作操作结果结果延伸延伸
