1、动保中心动保中心血凝（血凝（HAHA）与血凝抑制（）与血凝抑制（HIHI）报告人：陈雪梅、张俊报告人：陈雪梅、张俊 部部 门：动保中心门：动保中心 时时 间：间：2012-2-12 主要内容：主要内容：n一、实验原理一、实验原理n二、实验材料二、实验材料n五、实验方法与结果判定五、实验方法与结果判定n六、举例说明六、举例说明n七、注意事项七、注意事项 化验室是生产技术部一部分，和生产密切相关。化验室是生产技术部一部分，和生产密切相关。我们主要负责各养殖场场鸡群的抗体检测工作。我们主要负责各养殖场场鸡群的抗体检测工作。主要抗体检测：血凝抑制试验主要抗体检测：血凝抑制试验n 抗体是鸡群接触抗原（包
2、括疫苗和有害病原微生物）抗体是鸡群接触抗原（包括疫苗和有害病原微生物）体内产生的特异性蛋白质。体内产生的特异性蛋白质。n 他能很好反映机体的感染或抵抗状况他能很好反映机体的感染或抵抗状况1、血凝试验（、血凝试验（HA）原理：）原理：某些病毒或某些病毒或病毒的病毒的血凝素血凝素能能选择性地选择性地使某种动物地使某种动物地红细胞红细胞发生凝集，发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反也称直接血凝反应。应。病病毒毒颗颗粒粒红红细细胞胞2、血凝抑制试验（、血凝抑制试验（HI）原理：）原理：当病毒的悬液中加入当病毒的悬液中加入特特异性抗体异性抗体，且这
3、种抗体的量足以，且这种抗体的量足以抑制抑制病毒颗粒或其血凝素时，则病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表红细胞表面的受体面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。）反应，也称血凝抑制反应。抗体抗体抗原抗原 I am late I am late！3 3、抗原：、抗原：凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体结合而发生特凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体结合而发生特异反应的物质称为抗原。异反应的物质称为抗原。4 4、抗体：抗体：是机体受到抗原物质刺激
4、产生的具有特异性的免疫是机体受到抗原物质刺激产生的具有特异性的免疫球蛋白，它能与相应的抗原结合，发生特异性反应，并具有一定的消球蛋白，它能与相应的抗原结合，发生特异性反应，并具有一定的消除病原微生物及其产物的物质。除病原微生物及其产物的物质。适用范围：适用于对鸡新城疫适用于对鸡新城疫(ND)(ND)，禽流感，禽流感(H9(H9、H5-4H5-4、H5-5)H5-5)抗抗体滴度的检测。体滴度的检测。材料准备材料准备n 离心机（离心红细胞和离心血清）离心机（离心红细胞和离心血清）n 冰箱（存放抗原和血清）冰箱（存放抗原和血清）n 振荡器（振荡振荡器（振荡9696孔孔V V型板）型板）n 抗原抗原
5、：新城疫（新城疫（NDND）、流感（）、流感（H9H9、H5-4H5-4、H5-5H5-5）抗原（从指定厂家买稳定的浓缩抗原）抗原（从指定厂家买稳定的浓缩抗原）n1%1%红细胞悬液红细胞悬液、PBS PBS液（做血清稀释液用、配制液（做血清稀释液用、配制4 4单单位抗原）位抗原）n 离心管和离心盒（保存血清）离心管和离心盒（保存血清）n 96 96孔孔V V型板型板(稀释血清稀释血清)n 单道、八道移液器单道、八道移液器 、十二道移液器和枪头（加样、十二道移液器和枪头（加样、稀释血清）稀释血清）n 积液巢（盛积液巢（盛PBSPBS液及配制液及配制4 4单位抗原）单位抗原）u 附录附录 1 1P
6、BSPBS液配制液配制 准确称取准确称取NaCl 24gNaCl 24g、NaNa2 2HPOHPO4 4 8.7g8.7g、KCl 0.6gKCl 0.6g、KHKH2 2POPO4 4 0.6g0.6g，加蒸馏水至，加蒸馏水至3 3000mL000mL，加热溶解后调，加热溶解后调pHpH值至值至7.27.2，121121高压灭菌高压灭菌15min15min，44保存备用。保存备用。u 附录附录 2 2 1%1%鸡红细胞悬液制备鸡红细胞悬液制备 采集至少采集至少3 3只只SPFSPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积公鸡的血液与等体积PBS
7、PBS液混合，将混合液液混合，将混合液10ml10ml装入带刻度离装入带刻度离心管，配平后放入离心机中，经心管，配平后放入离心机中，经2000r/min2000r/min，离心，离心4min4min。用吸。用吸管吸去上清液与白细胞、弃去，将沉淀的红细胞加生理盐水管吸去上清液与白细胞、弃去，将沉淀的红细胞加生理盐水洗涤，如此反复离心三次，第四次离心时洗涤，如此反复离心三次，第四次离心时2500r/min2500r/min，离心，离心5min5min，将最后一次离心后的红细胞泥，按，将最后一次离心后的红细胞泥，按1%1%的稀释度加入的稀释度加入PBSPBS液中稀释，液中稀释，44保存备用。保存备用
8、。血凝（血凝（HAHA）试验）试验采用采用9696孔孔V V型反应板，测定抗原效价型反应板，测定抗原效价1 1、首先用微量移液器向反应板的每孔加、首先用微量移液器向反应板的每孔加PBSPBS液液3030微升。微升。2 2、用微量移液器吸取待测抗原、用微量移液器吸取待测抗原3030微升于第一孔中并挤压微升于第一孔中并挤压6 6-7 7次混合，之后吸出次混合，之后吸出3030微升至第微升至第2 2孔，依次倍比稀释到第孔，依次倍比稀释到第1111孔、孔、弃去弃去3030微升。微升。1212孔为红细胞对照孔。每种抗原孔为红细胞对照孔。每种抗原4 4个平行对照。个平行对照。3 3、用微量移液器再向反应板
9、的每孔加、用微量移液器再向反应板的每孔加PBSPBS液液3030微升。微升。4 4、微量移液器再吸取、微量移液器再吸取1%1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔红细胞悬液依次加入各孔，每孔3030微微升。升。5 5、置于微量振荡器上振荡、置于微量振荡器上振荡10-3010-30秒。秒。6 6、室温静置、室温静置4 40 0分钟后观察结果。分钟后观察结果。12345678910111224 816 32 64 128 256 5121024 2048红细胞对照PBS液303030303030303030303030抗原3030303030303030303030弃去30红细胞3030303030303
10、03030303030结果 操作示意图操作示意图结果观察：将反应板倾斜成将反应板倾斜成4545度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞平铺孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红集；如果孔底的红细胞平铺孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。滴
11、度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩如彩1 1所示第所示第8 8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1 1：256256。l 血凝实验主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞血凝实验主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制实验所用病毒的稀释倍数（抗原单位）凝集抑制实验所用病毒的稀释倍数（抗原单位）u 4单位抗原校正单位抗原校正1 1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4 4单位抗原。例：上图单位抗原。例：上图 1 1抗原效价为抗原效价为1 1：256256，HIHI试验时，
12、试验时，3030微升抗原稀释液内须含微升抗原稀释液内须含4 4个凝集单位，则个凝集单位，则应将应将 抗原作抗原作256/4=64256/4=64倍稀释。即取倍稀释。即取0.10.1毫升抗原，加入毫升抗原，加入6.46.4毫升毫升PBSPBS液。液。2 2、首先用微量移液器向反应板的第、首先用微量移液器向反应板的第1 1孔至第孔至第5 5孔加生理盐水孔加生理盐水3030微升。微升。3 3、用微量移液器吸取、用微量移液器吸取4 4单位抗原单位抗原3030微升分别加入第微升分别加入第1 1孔中，从第孔中，从第1 1孔开始挤压孔开始挤压6-76-7次混合，后吸出次混合，后吸出3030微升至第微升至第2
13、 2孔，依次倍比稀释到第孔，依次倍比稀释到第5 5孔，弃去孔，弃去3030微升。微升。4 4、用微量移液器再吸取、用微量移液器再吸取1%1%红细胞悬液依次加入红细胞悬液依次加入1-1-5 5孔，每孔孔，每孔3030微升。微升。5 5、于微量振荡器上振荡、于微量振荡器上振荡10301030秒。秒。6 6、室温静置、室温静置4040分钟后观察结果。分钟后观察结果。7 7、结果观察：第、结果观察：第1 1、2 2孔为完全凝集，第孔为完全凝集，第3 3孔红细胞为孔红细胞为50%50%沉淀，第沉淀，第4 4 孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4 4单
14、位抗原准确，校正单位抗原准确，校正 成立。如图成立。如图2 2所示。所示。血凝抑制（血凝抑制（HI）试验）试验每排每孔检测每排每孔检测1 1份血清。步骤如下：份血清。步骤如下：1.1.用微量移液器先加用微量移液器先加3030微升微升PBSPBS液于各孔中。液于各孔中。2.2.用微量移液器吸取待检血清用微量移液器吸取待检血清3030微升置于第微升置于第1 1孔中，然后倍孔中，然后倍比稀释至第比稀释至第1111孔，弃去孔，弃去3030微升。最后一孔不稀释，为红细胞微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。对照。3.3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔3030微升（微升
15、（1-121-12）。）。4.4.置于微量振荡器上振荡置于微量振荡器上振荡10-3010-30秒，混合均匀。秒，混合均匀。5.5.室温静置室温静置3 30 0分钟。分钟。6.6.用微量移液器吸取用微量移液器吸取1%1%红细胞悬液于每孔各加红细胞悬液于每孔各加3030微升。微升。7.7.置于微量振荡器上振荡置于微量振荡器上振荡10-3010-30秒，混合均匀。秒，混合均匀。8.8.室温静置室温静置4 40 0分钟后观察结果。分钟后观察结果。u 结果判定：结果判定：1 1）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的清最大稀释度为该血清的HIHI滴度
16、，以滴度，以2 2的指数表示。见图的指数表示。见图3 3：图3 上图抗体结果从上至下依次为：8/7/8/9/8/7/7/62 2）判定标准：）判定标准：1.1.NDND抗体：育雏育成鸡在抗体：育雏育成鸡在6 6以上，产蛋鸡在以上，产蛋鸡在8 8以上。以上。2.H52.H5体：抗体值在体：抗体值在6 6以上。以上。3.H93.H9抗抗体：抗体值在抗抗体：抗体值在7 7以上。以上。能将能将4 4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价注：在实际生产中，则以实际免疫程序
17、进行分析抗体滴度值注：在实际生产中，则以实际免疫程序进行分析抗体滴度值的高低。的高低。免疫后抗体规律免疫后抗体规律一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持1-2个月。灭活疫苗免后10-15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月对H5抗体要求611，低于5时及时免疫H9抗体在7-11，当最低抗体为6时及时免疫H9单苗ND抗体在7-12 产蛋鸡最低值7补苗u 实验后处理：实验后处理：n 96 96孔孔V V型反应板的清洗：型反应板的清洗：自来水冲洗自来水冲洗 、甩干、甩干 泡酸泡酸 自来水冲洗自来水冲洗、甩干、甩干 纯净水冲洗甩干两次纯净水冲洗甩干两次 6 6
18、00烤干烤干n 抗原空瓶：抗原空瓶：高压灭菌高压灭菌 回收利用或弃去回收利用或弃去n读取抗体值：读取抗体值：记录记录 汇总汇总 存档存档实验室抗体检测对实际生产的重要性实验室抗体检测对实际生产的重要性n 母源抗体能反映一个鸡场的种源种鸡的健康程度，如果种母源抗体能反映一个鸡场的种源种鸡的健康程度，如果种源出现问题，这批鸡肯定不好养。源出现问题，这批鸡肯定不好养。母源抗体加上2-3个滴度就是种鸡群的抗体结果：所以母源抗体个体值ND、H9达到2log12，H5达到2log10是不正常的。从母源抗体推测出，种鸡抗体肯定有2log14个体，说明种鸡感染H9n种鸡群发生过新城疫，雏鸡抗体表种鸡群发生过新城疫，雏鸡抗体表现有现有12的。的。n感染或发过病感染或发过病注意事项注意事项n 1 试验用待检血清必须新鲜，腐败者或溶血不能使用，血清避免阳光照射。n 2 每次试验前都需进行抗原标定。n 3 来源不同的红细胞对其效价有一定影响。n 4 试验温度要在室温下进行。汇报完毕，请各位领导同事批汇报完毕，请各位领导同事批评指正，谢谢！评指正，谢谢！
