1、细胞生物学实验Cell Biology Experiment目 录1.显微镜的结构及细胞形态观察、大小测量和死活细胞鉴定2.液泡系和线粒体的活体染色3.叶绿体的分离与观察4.DNA的细胞化学Feulgen反应5.多糖的显示PAS反应6.细胞内碱性蛋白和总体蛋白的原位显示7.细胞骨架的光学显微观察和永久制片技术8.植物原生质体的制备与融合9.蚕豆根尖微核试验10.膜的通透性11.血细胞的分化和不同类型血细胞的观察实验报告要求1注意页面四边留白，不要挤到页边！2抬头填写完整。3注意事项自己总结，不要抄袭！4组长检查后上交存档。生物绘图注意事项12H 以上绘图铅笔削尖、绘图橡皮、直尺 2边看显微镜边
2、按视野中实际情况绘图，以精确为主，不能艺术加工。3应找到最典型、最能说明绘图目的的物像来绘图。先轻勾出轮廓，检查无误后，再以准确清晰的线作最后描绘。实线表示轮廓，虚线表示被遮蔽但需表现的轮廓，线粗细应均匀有规律圆点的疏密表示明暗、凹凸（越暗的地方点越多）点点时笔尖直立，点大小、疏密要均匀、整齐、浑圆，不能像“，”。4用尺向右侧引出水平指示线，线右端平齐字注在右侧。图下方写上所画图的名称及放大倍数。图的右侧和下方需写文字说明，所以图应绘在绘图纸上偏左上方的位置。 5一幅图只要详细画出部分结构，其余勾画出轮廓即可。 规范 不规范实验一 普通显微镜的使用及细胞形态观察、大小测量和死活细胞鉴定一、实验
3、目的1熟悉普通光学显微镜的基本构造和性能，掌握使用方法。2了解细胞的一般形态和基本结构。3掌握显微测微尺的使用，对细胞大小有一直观认识。4了解鉴定死活细胞的方法。二、实验原理1显微测微尺的使用 镜台测微尺：表示绝对长度，长1 mm，分成100小格，每小格为0.01mm。不被用来直接测量，而是用它来校正目镜测微尺，故其质量对所测微体影响极大。 目镜测微尺：是一块比目镜筒内径稍小的有标尺的圆形玻璃片，标尺长10毫米、分为100格。需要镜台测微尺校正为绝对长度再测定细胞大小。2死活细胞鉴定:台盼蓝是一种低毒的活体染色剂，只能透过质膜受损的细胞或死细胞。三、实验用品1试验材料： 洋葱内表皮细胞 口腔上
4、皮细胞、（人的口腔上皮细胞是扁平、多边形的，形状不很规）2试剂 0.2%台盼蓝溶液3仪器 测微尺（2套）、普通光学显微镜、刀片、镊子、玻璃滴管、吸水纸、牙签。四、试验方法一、细胞死活的鉴定0.2%台盼蓝染色5-10分钟后进行观察。二、细胞大小测量1）测量时，镜台微台尺换成样本，2)目镜测微尺来测量细胞的大小3)改变显微镜的放大倍率，则需对目镜测微尺重新进行标定。三、细胞形态的观察五、注意事项取口腔黏膜上皮细胞注意的问题 1口腔上皮细胞主要分布在口腔两侧颊部。用消毒牙签的钝端，在漱净的口腔任意一侧的颊部，轻轻刮几下。2取材前，口腔一定要用清水漱净，去除口腔内的食物残渣。 3用方签在口腔壁上轻轻刮
5、动，不要刮在牙缝里，因为牙齿上刮下来的是食物碎屑，不是口腔上皮细胞。六、作业1绘制口腔黏膜上皮细胞及洋葱内表皮细胞图（2-3个细胞）2列表写出洋葱内表皮细胞长轴、短轴长度，并计算平均值。（取3个细胞）3取口腔黏膜上皮细胞注意的问题4生物绘图注意事项实验二 线粒体和液泡系的超活染色与观察一、实验目的1、了解细胞和细胞器的超活染色技术。2、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡的形态、数量和分布,了解植物细胞液泡系的发育过程。二、实验原理 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡
6、。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。 体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的电化学特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此就发生了吸引作用。但不是
7、任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，Janus green B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。线粒体是细胞内重要的细胞器，线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶能使詹姆斯绿B保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。液泡是细胞内浓缩产物的主要场所，有十分重要的功能。中性红是液泡的特殊染色剂，将液泡染成红色。在活细胞中，细胞质和细胞核不着色。如果细胞死亡，染料会弥散开来，
8、使核着色。三、实验用品（一）器材显微镜、恒温水浴锅、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸等。（二）试剂1、Ringer 溶液 生理盐水、缓冲液 氯化钠0.85g（变温动物用0.65g） ；氯化钾 0.25g ； 氯化钙 0.03g ；蒸馏水100ml2、10%、1/3000中性红溶液 称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液，稍加热（30-40度）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。 临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。31%、1/5000詹姆斯绿B溶液 称取50mg詹姆斯绿B溶于5
9、ml Ringer溶液中，稍加 微热（30-40度）使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液1ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液，装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。 （三）材料人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞、小麦幼根根尖。四、实验方法(一) 线粒体的超活染色与观察1、人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察载玻片 37水浴锅的金属板滴两滴詹纳斯绿B染液牙签从口腔粘膜刮取上皮细胞放入载玻片染液染色10-15分钟（注意不可使染液干燥, 必要时可再加滴染液） 盖上盖玻片用吸水纸吸去四周溢出的染液观察2.洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色载玻片撕取一小
10、片洋葱鳞茎内表皮滴一滴詹纳斯绿B染液染色10-15分钟吸去染液加一滴Ringer液，注意使洋葱内表皮展平盖上盖玻片观察（二） 液泡系的超活染色与观察 刀片小麦幼苗根尖切一纵切面中性红染色5-10分钟吸去染液加一滴Ringer液盖上盖玻片镊子轻轻下压盖玻片观察五实验结果 在小麦根尖细胞制片中，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分空间，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。六注意事项1、詹姆斯绿B溶液现用现配，以
11、保持它的充 分氧化能力。2、实验中速度要快，以免组织细胞死亡。七、作业1 画出你所观察到的线粒体和液泡的图像.2 总结实验成功或失败的原因.实验三 叶绿体的分离与观察 一、实验目的通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。二、实验原理细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离。叶绿体的分离采用在等渗溶液中进行组织匀浆、分离。叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行。差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此
12、类推，达到分离不同大小颗粒的目的。差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。三、实验用品1.材料： 菠菜叶片2.试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液3.仪器：普通离心机、天平、显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、离心管、吸水纸等四、实验方法1.菠菜叶片(去叶脉)3g 0.35mol/L氯化钠15ml研磨(冰浴)匀浆过滤(6层纱布)滤液在1000rpm离心2min弃沉淀，上清液3000rpm离心5min 去上清液沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮 滴片观察2.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用用
13、普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构3.菠菜叶手切片观察新鲜菠菜叶，刀片切出一斜面置于载玻片上，滴加1-2滴NaCl溶液，盖上盖片，显微镜下观察。用镊子摄取或刀片刮取新鲜菠菜叶片叶肉，滴加1-2滴NaCl溶液，作临时装片。五、实验结果1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。2.菠菜叶手切片在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞、保卫细胞、叶肉细胞。叶肉细胞呈长方形或类方形，内含大量带有绿色的叶绿体颗粒。另外，视野下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。3.红辣椒细胞中有许多红色小颗粒，这就是杂色体。杂色体分散在细胞质中。六、注意事项1.叶
14、绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。2.分离过程最好在0-5的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。3.离心机使用：离心管要平衡七、作业1.根据显微观察结果，绘制菠菜叶的结构模式图。实验四 细胞骨架的光学显微观察和永久制片技术一、实验目的掌握植物细胞内细胞骨架的光学观察方法，了解细胞骨架在细胞内的分布特点。二、实验原理细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Tr
15、iton X-100处理细胞，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，而细胞骨架系统的蛋白质被保存， 再用考马斯亮蓝R250染色，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。 Triton X-100：是非离子型表面活性剂（去污剂）。适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存。这样，使细胞骨架图像更清晰。考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨
16、，因此我们看到的主要是微丝组成的应力纤维（微丝束），直径约40nm左右。 戊二醛能固定，较好的保存细胞骨架成分。M缓冲液： 稳定F-肌动蛋白使得细胞骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。磷酸缓冲液（PBS）：含有生理盐水，可使细胞不被破坏，能保持原有状态下的结构。三、实验用品1.实验材料 新鲜洋葱鳞茎的内表皮。2.实验器材 普通光学显微镜、 10mL小烧杯、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、载玻片、盖玻片、擦镜纸、PH 计、水浴锅。 3.试剂： M缓冲液、磷酸缓冲液（PBS）、3%戊二醛、1%Triton-100、0.2%考马斯亮蓝R250四、试验方法1. 用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片（
17、约0.5cm2大小若干片），置于1.5ml离心管中，加入PBS（1.5mL左右），使其下沉（10min左右）。2. 吸去缓冲液，用1%Trion X-100处理15-20min。3. 吸去Trion X-100，用M缓冲液洗3次，每次5min。4. 用3%戊二醛固定30min。5. PBS （1.5ml左右）洗3次，每次3min，滤纸吸去残液。6. 0.2%考马斯亮蓝R250染色至少30min。7. 蒸馏水洗涤2次，然后将样品置于载玻片上，加盖玻片，在普通光学显微镜下观察。8.选取观察效果好的制作永久切片于脱水剂中每级5-10min，第一滴阿拉伯树胶封片。五、实验结果观察：镜下可见洋葱表皮细胞
18、轮廓，微丝束呈深蓝色。转换高倍镜观察，转动微调，可见细胞骨架的立体结构。六、注意事项：1.撕取洋葱鳞茎内表皮不可带茎肉，样本要展开铺平。2.去垢时间不要超过30min。3.染色时间需掌握好，必要时可分别设不同染色时间比较。4.由微丝组成的应力纤维（张力纤维）是一种动态结构，细胞充分贴壁铺展时纤维挺直、丰富；反之，细胞收缩变圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显稀少。七、作业绘出植物细胞骨架微丝的分布图。（2-3个细胞）补充： 6mmol/L PBS(pH6.8)A液：NaH2PO42H2O 936mg/1000mlB液：Na2HPO412H2O 2148mg/1000ml工作液：A液53.7m
19、l + B液46.3ml（用NaHCO3调pH值至6.8） M缓冲液（pH值7.2）咪唑 50mmol/L KCl 50mmol/L MgCl2 0.5mmol/L EGTA 1 mmol/L EDTA 0.1 mmol/L 巯基乙醇1 mmol/L 甘油4 mmol/L 加蒸馏水至1000ml，用1mol/L HCL调pH值为7.2。 1%TritonX-100: TritonX-100 1ml M缓冲液99ml 0.2%考马斯亮蓝R250染液：考马斯亮蓝R250 0.2g甲醇 46.5ml冰醋酸 7ml蒸馏水 46.5ml 5.3%戊二醛25%戊二醛12mlPBS （2液） 88ml脱水剂
20、 50%乙醇 70%乙醇 95%乙醇 100%乙醇二甲苯实验五 DNA的显示 Feulgen反应一、实验目的1、了解Feulgen染色反应原理；2、掌握Feulgen染色的方法，观察染色结果。二、实验原理根据DNA经盐酸水解后，打开了嘌呤碱基和脱氧核糖连接的键，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。这些醛基就在原位与Schiff试剂结合，形成紫红色的化合物。所以凡有DNA的部位，就呈现为紫红色。Feulgen反应是特异性显示DNA的最经典方法，即可进行DNA定位显示，又可用显微分光光度计进行定量分析。Feulgen反应对组织中DNA的检测具有高度专一性。组织中除DNA外还有多糖、RNA和其他自由醛基
21、可以被盐酸酸解掉。三、实验用品四、实验方法取小麦根尖和洋葱内表皮（绿豆大小）浸入预热至60的1N HCl中水解，时间10 min。蒸馏水洗后，转入Schiff液中避光染30 min，待根尖变为深红色；在新配亚硫酸水中洗3次，每次 1 min；自来水洗 5 min，在载玻片上切下深红色根尖备用；制片镜下观察，根尖镊子捣碎压片。五、注意事项六、作业绘图描述所观察到的试验结果。 实验六 多糖的显示PAS反应一、实验目的通过PAS反应，了解糖原显示的基本原理、方法以及糖原在细胞中的分布。二、实验原理PAS反应是显示多糖的最经典、也是最直接的细胞化学方法。用具有强氧化作用的过碘酸处理使多糖中葡萄糖的乙二
22、醇基氧化成两个游离的醛基，醛基与Schiff试剂结合可形成紫红色的化合物，颜色深浅与多糖含量成正比。单糖易被抽提掉，多糖包括糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂、淀粉和纤维素。三、实验用品1.材料：马铃薯块茎2.试剂：0.5%高碘酸、schiff试剂、亚硫酸水、 70酒精3.器材：显微镜、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、水浴锅四、实验方法1、取马铃薯块茎切成薄片，浸入过碘酸溶液10分钟；2、用70的酒精冲洗1次；3、将薄片放入Schiff试剂中2025分钟；4、在新配亚硫酸水中洗3次，每次 1 min；5、蒸馏水洗片刻；6、将薄片放在载玻片上吸去水分，加上盖玻片，镜下观察。五、注意事项按上述操作，细
23、胞中水溶性糖类已丧失，被染色的是不溶性的碳水化合物。六、作业绘制实验结果，并描述。实验六 细胞内碱性蛋白和总体蛋白的原位显示一、实验目的1.掌握细胞内酸、碱性蛋白的鉴别方法；2.了解酸、碱性蛋白在细胞内的分布情况。二、实验原理 蛋白质是一种两性电解质，在碱性环境中，蛋白质带负电，在酸性环境中，蛋白质带正电。所以，利用各种蛋白质在不同ph下，因等电点不同而产生的与固绿染液（一种弱酸性染料它对碱性物质的亲和力强）结合能力的差异 。对细胞中的蛋白质染色，可使细胞内的酸性蛋白（等电点偏向酸性）和碱性蛋白（等电点偏向碱性）分别显示。总体蛋白pI4.7-6.75，组蛋白pI8.5。试验用酸性染料pH2.2
24、 ，碱性染料pH8.0 核酸的存在会影响实验结果,用三氯醋酸处理可提出核酸。三、实验用品1、试验材料洋葱鳞茎内表皮或根尖2、试剂10%福尔马林、5%三氯醋酸、0.1%酸性固绿染料（酸染）、0.1%碱性固绿染料（碱染）3、器材显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、吸水纸四、实验方法1.材料固定 洋葱鳞茎内表皮若干片，10%福尔马林固定液中固定15min，蒸馏水洗2次。2.抽提核酸 5三氯醋酸中90 ，15min，蒸馏水洗数次（3min以上）以冲去痕迹的三氯醋酸。3.染色 一张片滴加0.1碱性固绿(pH8.0)中染色510min。 另一张片滴加0.1酸性固绿(pH2.2)中染色510min(视染色深浅而
25、定) 。 蒸馏水冲洗（3min），盖上盖片镜检。五、实验结果用PH2.2酸性固绿染液染色结果，细胞中蛋白质均被染成绿色，此即总体蛋白在细胞内的分布。总体蛋白-碱性蛋白=酸性蛋白。用pH8.0碱性固绿染液染色结果，只有细胞核内染色质被染绿色（或浅蓝色），此即碱性蛋白在细胞内的分布。 六、注意事项使用三氯醋酸处理的目的？用5%TCA提取DNA是该实验中的关键。 DNA必须被提取，以使染色质的负电荷下降，用热TCA提取核酸后，固绿在碱性pH下，碱性蛋白可以选择性地被染色，如未被提取，不能染色，或整个切片染成蓝绿色，水洗或进入酒精即褪色。七、作业1、绘制酸、碱性蛋白在细胞内的分布图。2、总结本次实验的
26、得失。实验八 植物原生质体的制备与融合一、实验目的1.学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。2.学习细胞融合技术，观察融合细胞的形态及变化。二、实验原理 除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体，是开展基础研究的理想材料。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，常用酶解法分离原生质体，其原理是使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。细胞融合又称细胞杂交指离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法
27、。PEG作为一种高分子化合物，2050的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。三、实验用品1.器具：显微镜、离心机、离心管、剪刀、镊子、吸管、小培养皿、载片、盖片、300目滤网 。 2.试剂：酶混合液、洗涤液、 20%蔗糖液、PEG溶液、高钙高pH溶液 (1)酶混合液(9CPW): (2)洗涤液（9CPW）1纤维素酶 pH 5.6 0.5-0.7果胶酶272 mgL KH2PO4101.0 mgL KNO314800 mgL CaCl22H2O2460 mgL MgSO4016 mgL KI0025 mgL CuSO
28、49 WV甘露醇500mgL MESpH 5.6(3)PEG融合液（pH 5.6 ）40% PEG (MW 1000-6000)0.3 mol/L葡萄糖3.5mmol/L CaCl22H2O0.7mm0l/L KH2PO4（4）高钙高pH溶液（pH 10.5 ）0.1mol/L CaCl22H2O0.1mol/L甘露醇0.05mol/L Tris3.材料：菠菜、韭菜叶片四、实验方法1、分离原生质体 撕叶下表皮 酶解 将撕去下表皮的叶片剪成0.5mm宽小块，放在盛有5mL酶液的小培养皿或带盖三角瓶中，让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层，在25-28下酶解60-90分钟。可镜检有较多原生质体后停
29、止。2、收集纯化 用300目网过滤除去未完全消化的残渣。酶解液转移至10mL离心管中，配平，以800rpm离心5分钟以上，使原生质体沉降。移液管吸上清，剩下原生质体及残渣于管底。 加入3ml CPW洗涤液，轻轻吹打均匀，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，以彻底去除酶液。加入少量CPW洗涤液，轻轻吹打均匀，用注射器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖约23mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液。 以600rpm离心10分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体，注射器针头轻轻插入离心管底部吸取碎片和蔗糖溶液，再吸去上清。3、制备效果检测（1）血球计数板计数（2）原生质体活力测定 形态识别（
30、完整、饱满、颜色鲜艳） 中性红染色（液泡变红） 台盼蓝染色（不能显色） 观察10个视野计算：存活率=（活性原生质体/原生质体总数）100%4、原生质体融合 （1）取原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置810分钟，使原生质体沉降。（2）在两液滴之间滴加一滴40的PEG溶液，使三液滴相连（可转动载玻片使其混匀）室温下（15-20 ）静置5-10分钟，观察原生质体聚集（粘连）现象。（3）滴加高钙高PH洗液，转动载玻片使其混匀，观察原生质体融合过程。五、作业1.按镜下观察绘制2-3个原生质体。2.计算原生质体浓度和存活率。3.描述原生质体融合过程。实验九 蚕豆根尖微核检测技术一、实验目的 1、
31、了解细胞微核形成的机理及其形态特点，2、学习植物根尖细胞的微核检测技术。二、实验原理微核试验(The micronucleus test，MNT)是以动植物为材料，采用细胞生物学手段，观测其出现的微核率来表示材料受遗传损伤程度的一种检测遗传毒物的方法。微核是指位于细胞质中独立于主核、直径小于主核，完全与主核分开的圆形或椭圆形的微小核。是真核生物细胞中的一种异常结构，它是由于细胞受到损伤后，由细胞分裂过程中丧失着丝粒的染色体断片或落后染色体产生的。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。 蚕豆根尖细胞微核技术已发展的相当成熟，具有较高的灵敏性，作为检
32、测化学品遗传毒性的方法，得到了广泛应用 。 而且在测定监测淡水污染物和检测化学诱变剂的研究已列入国家生物监测技术规范（水环境部分），并推广应用于大气、废水、土壤等的致突变活性检测 。三、实验用品1.材料：蚕豆2. 器材 显微镜、恒温培养箱、纱布、镊子、载玻片及盖玻片等。3.药品 盐酸（5mol/L）、70%乙醇、卡诺固定液（用乙醇和冰醋酸以3:1（v/v)混合配制）、石炭酸品红、硫酸铜、待测液。四、实验步骤1、浸种催芽 将实验用蚕豆按需要量放入盛水烧杯中，在25下浸泡2448小时，此间至少换水两次，所换水应25预温。 种子吸胀后，用纱布松散包裹置瓷盘中，保持温度，在25温箱中催芽1224小时。
33、 待初生根长出23mm时，再取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中，25继续催芽，经约36-48小时，大部分初生根长至12cm左右，此时可用来进行实验。2、根尖染毒： 选取初生根生长良好，根长一致的68粒种子，放入盛有待测液的培养皿中，阳性检测采用200mg/L硫酸铜,对照用蒸馏水处理，处理时间6-24h，处理液浸没根尖。3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次23min，洗净后在蒸馏水中恢复培养24h。4、固定：切取1cm左右的根尖，用卡诺氏固定液固定24h后弃去固定液，固定后的根如不及时制，可换入70%的乙醇溶液中置4冰箱中保存备用。5、酸解：用蒸馏水浸洗固定好的幼根23次，每次5
34、分钟，吸净蒸馏水，加入5mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10min，幼根软化即可，弃去盐酸，漂洗根尖23次，每次12分钟，彻底洗净盐酸。6、染色：截下1-2mm长的根尖，滴加适量的石炭酸品红染液，染色10min，加盖玻片，压片观察。五、注意事项1、培养蚕豆时需勤换水2、处理蚕豆时要将根部浸没于处理液中3、固定液要现配现用六、实验结果 污染指数PI值评价水质标准表 污染指数PI值 水质污染等级 基本无污染 0 1.5 轻污染 1.5 2.0 中污染 2.0 3.5 重污染 3.5以上 七、作业绘图、计算微核千分率和污染指标。实验十 细胞膜的渗透性 一 、实验目的1.了解溶血现象及其发生机制。
35、2.了解细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞的速度。二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障，是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。小的、亲脂性的、非极性分子（如O2、CO2、 N2、苯）容易溶解于脂双层，可迅速透过脂双层。小的、不带电荷的极性分子（如水、脲、甘油等）如果足够小时，也能很快透过脂双层；大的、不带电荷的极性分子（如葡萄糖，蔗糖等）以协助扩散或主动运输进入细胞；对于带电荷的分子或离子，由于这些分子的电荷及高的水化度，因此不管多小，都很难透过脂双层的疏水区，它们要通过载体介导的主动运输方式跨膜运输。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白
36、释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，有的溶质可进入，有的溶质不能进入，进入红细胞的溶质能提高红细胞的渗透压，使水进入红细胞，引起溶血。由于不同溶质透入速度不同，溶血时间也不同，因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。三、实验用品1材料: 鸡血溶于含有抗凝剂的等渗液中（肝素钠0.2mg/mL,一般范围在 0.01-0.2mg/mL；等渗液为0.85% NaCl）2器材： 试
37、管，试管架，滴管，载玻片，盖玻片，光学显微镜。3试剂：低渗溶液：0.0085% NaCl和0.032mol/L葡萄糖；等渗溶液：0.85% NaCl、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇。10% TritonX-100、2%TritonX-100。四、实验步骤1、制备血液稀释液 抗凝剂的制备：首先称取1克肝素钠粉末，然后加入0.17 M NaCl溶液 10 ml（110的比例），混合均匀，制成肝素抗凝剂。 血液稀释液的制备：鸡翼下静脉取新鲜血液，按比例（肝素抗凝剂:血液=110）混合均匀，配制成经肝素抗凝的血液。 按比例（经肝素抗凝的血液0. 17 M Na
38、Cl 溶液=110）混合均匀，形成一种不透明的红色液体。2、低渗溶液溶血现象观察： 取试管一支加蒸馏水3ml和稀释的鸡血1滴或2滴轻混一下，然后静止注意观察溶液的颜色变化。 结果：由于红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶 血，使光线比较容易透过溶液，溶液颜色由浑浊的红色逐渐变透明，此即为溶血现象。记录下这个过程所要的时间。3、鸡红细胞的渗透性记时比较1）分别取2只试管，各加入3ml的0.85% NaCl 、0.0085% NaCl和0.032mol/L葡萄糖 加入2-3滴血红细胞悬液； 2）分别取3只试管，各加入3ml的 0.32 molL葡萄糖，0.32 molL甘油，0.32 molL乙醇
39、，加入2-3滴血红细胞悬液；3）分别取2只试管，各加入3ml的10% TritonX-100、2%TritonX-100；加入2-3滴血红细胞悬液，观察反应现象。记下时间（自加入稀释血液到溶液逐渐由红色变为透明澄清，红血球全部溶血所需时间），填入表一的空格中。4、溶血结果的判断不溶血：液体分2层，上层浅黄色透明，下层红色不透明，镜检红细胞完好。不完全溶血：溶液混浊，上层变红色，镜检有部分红细胞破裂。完全溶血：液体变红而且透明，镜检发现细胞全成碎片。5、显微观察血液红细胞的观察滴一滴稀释的血液于载玻片上，盖上盖玻片。用光学显微镜观察细胞的种类、形状和颜色。细胞破碎的观察在上一步的载玻片的一端滴加
40、清水，在另一端吸水，并在显微镜下观察细胞的破裂。五、实验结果将观察到的现象记录，并进行分析。编号试 剂是否溶血时间分析原因10.85% NaCl20.0085% NaCl30.32 M葡萄糖40.32 M 甘油50.32 M 乙醇610% TritonX-100 六、注意事项1. 试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。2. 取鸡血动作要非常迅速，否则鸡血会凝固。或者先把抗凝剂加入到烧杯中，再加入新鲜的鸡血，边加边震荡即可。3.长时间在等渗溶液中，由于活细胞会产生代谢产物积累，也会产生溶血，试验时间不宜超过1h。4.装不同试剂试管注意编号，吸管也要专用切勿混淆，以保
41、证实验结果的准确性。补充：一、细胞膜的功能分隔形成细胞和细胞器，为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境，膜的面积大大增加，提高了发生在膜上的生物功能；屏障作用，膜两侧的水溶性物质不能自由通过；选择性物质运输，伴随着能量的传递；生物功能：激素作用、酶促反应、细胞识别、电子传递等；物质转运功能：细胞与周围环境之间的物质交换，是通过细胞膜的转运功能实现的，其主要转运方式有四种，即单纯扩散、易化扩散、主动转运、入胞和出胞作用。细胞膜的受体功能：受体是细胞识别和结合化学信息的特殊结构，其本质是蛋白质。二、常用抗凝血剂包括：1.非肠道用药抗凝血剂：如肝素；2.香豆素抗凝血剂类：常用的有双香豆素 、华法令和新
42、抗凝等，通过拮抗维生素K使肝脏合成凝血酶原及因子、和减少而抗凝；3.抗血小板凝集药物：如阿司匹林，对血小板环氧化酶有抑制作用；4.蛇毒溶栓剂：如去纤酶、抗栓酶和清栓酶，可溶解已形成的血栓使血管再通，从而起到抗凝血作用。肝素的作用机理肝素在体内、体外均有强大抗凝作用。与其带大量负电荷有关，可使多种凝血因子灭活。这一作用依赖于抗凝血酶III（antithrombin III，AT III ）。At III是凝血酶及因子、等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。它与凝血酶通过精氨酸-丝氨酸肽键相结合，形成At III凝血酶复合物而使酶灭活，肝素可加速这一反应达千倍以上。实验十一 血细胞的分化和不同类型血细胞的观
43、察一、实验目的 1、学习掌握人血涂片和染色的方法。 2、了解各种血细胞的形态特征。二、实验原理 瑞氏染色液主要染料由碱性美蓝和酸性伊红两种成分组成,它们与细胞内的嗜酸性和嗜碱性的各种物质既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用, 各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样，因此使细胞呈现出不同的色彩.伊红和美蓝只能溶解在有机溶剂中，而滴在水中很快形成沉淀，所以染色液必须配成甲醇等有机溶液，临用时加到水或缓冲液中，才能在一定的环境下离解成有色的阴离子伊红和阳离子美蓝，而与细胞中的不同物质相亲和被染色。如滴加到水中很快发生沉淀，容易形成沉渣。甲醇兼溶剂和起固定细胞两种作用。甲醇具有强大的脱
44、水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。缓冲液作用： 染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH 一般在6.8，偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。缓冲液配制（pH6.4-6.8，弱酸性）。A：红细胞，B：嗜酸性粒细胞，C：单核细胞，D：中性粒细胞，E：嗜碱性粒细胞，F：淋巴细胞三、实验用品显微镜、载玻片、采血针、75%酒精、消毒棉球、瑞氏染液、PBS、吸耳球。四、实验方法1.消毒 先按摩取血部位，使血流通畅；再
