1、2023年5月7日星期日1 生物电子显微术河北农业大学生命学院2023年5月7日星期日2生物电子显微术1 绪论l基本概念lEM发展史lEM分类及特点l电镜技术的应用l各种显微镜性能与特点的比较2 电子显微镜的基本知识lTEM的结构和原理lSEM的结构和原理2023年5月7日星期日33 超薄切片技术l基本概念l普通超薄切片技术4 负染色技术5 金属投影和复型技术l金属投影技术l复型技术6 EM冷冻制样技术l概述l冷冻超薄切片技术l冷冻断裂(蚀刻)及复型技术l冷冻安全规则2023年5月7日星期日47 SEM的样品制备技术l 概述lSEM电镜的样品制备l特殊样品的制备8 电镜的应用(个案分析）l花粉
2、表面形态的SEM观察l熏蒸固定真菌的SEM观察l样品包埋块的制作l扫描电镜观察石蜡切片观察法l植物原生质体超薄切片的制作l真菌菌丝及孢子的包埋2023年5月7日星期日59 X-ray显微分析lX-ray微区分析的基本原理lX-ray显微分析仪工作的基本原理lX-ray显微分析的方法及应用10 其他显微技术l扫描隧道显微镜l原子力显微镜l激光扫描共焦显微镜l扫描电-声显微镜2023年5月7日星期日6生物电子显微术l课时安排l讲授：30学时l实验：10学时l主要内容：l电镜的原理、结构（TEM，SEM）l电镜的样品制备技术 1)超薄切片技术 4)金属投影及复型技术 2)负染色技术 5)SEM制样技
3、术 3)冷冻制样技术 6)其他制样技术l应用举例2023年5月7日星期日7主要参考文献1.生物电子显微术 张景强 中山大学出版2.实用生物电子显微术 林钧安 辽宁科技出版3.生物电子显微术教程 陈力 北师大出版4.电子显微镜与电子光学 黄兰友 科学出版5.生物医学电子显微技术 程时 北医、协和6.生物学工作者实用生物电子显微术 英 G1976 参考文献1，2，3图书馆均有2023年5月7日星期日8第一章 绪论1.1基本概念1.电子显微镜：简称电镜 利用电子束作为照明源，电磁透镜聚焦成像，并结合特定的机械装置，应用现代电子技术、高真空技术而制成的一种精密电子光学仪器。TEM：Transmissi
4、on Electron MicroscopeSEM：Scanning Electron Microscope2023年5月7日星期日92电子显微术：以电子显微镜为工具，对物质（样品）进行物理、化学、成分、超微结构等方面研究的一种技术。电子显微术定义:电子显微学是凝聚态物理、材料科学、乃至生命科学的交叉学科，是物质科学研究的一个重要组成部分。它是以电子显微学等方法,在原子尺度上对物质的微观结构进行研究分析,从而促进了新物质、新结构、新性能、新现象的发现，极大地推动了新材料、新器件的发展。2023年5月7日星期日103超微结构：指一般光学显微镜不能分辨的细微形态结构（亚显微 结构），直至生物大分子
5、结构（蛋白质、核酸、多糖、脂类）。4电子显微方法：Electron Microscopy 指利用电子与固体样品作用时所发出的信息，对样品 进行微区观察和分析的一种方法。1mm=103 m 1m=103nm 1nm=10 1=10-10m2023年5月7日星期日111.2 电子显微镜的发展概况l光学显微镜的发展(LM:light microscope)l光镜的诞生l人眼分辨率：人肉眼能分辨清楚的两点之间的最短距离用“”表示 l13世纪玻璃的发明 制造眼镜、放大镜l16世纪 欧洲放大镜=0.01 M=330倍l1590年 荷兰眼镜商Hans之子-Janssen装配具有划时代意义的“显微镜”l166
6、5年 英国物理学家Robert Hook(虎克)第一台光学显微镜l1675年 荷兰Leeuwen.Hook(列文.贺克 M=270倍,共研制247台光镜l高倍率的光镜l18世纪到19世纪中叶 英、法、意相继研制消色差色差显微镜 M=15002000 人的视力提高了1000多倍 0.2 m 2023年5月7日星期日123.光镜的局限性l1878年 德.理论光学家 E.Abbe提出 光镜的最优分辨率 opt=0.4*光l波的反射水波障碍物:石块产生的影子芦苇杆表1-1 电磁波各光谱区的一些参数及相应的结构分析方法 光谱区 波长/nm 波数1/)(cm 频率()/Hz 能量/eV 对应分析 方法 无
7、线电波 10131010 10-610-4 105109 10-1010-5 核磁共振 微波 109106 10-3101 1091011 10-510-3 顺磁共振 红外光 106103 101104 10121014 10-2100 红外光谱 可见光 8102 4102 1.31042.5104 3.810141015 1.6101 可见光谱 紫外光 4102 1102 2.5104105 10151.51016 101102 紫外光谱 X 射线 10210-2 106108 10161018 103106 X射线光谱 拉 曼 光 谱 2023年5月7日星期日14l可见光波长 400080
8、00 opt=0.4*光l 紫外线波长=3900130 紫外线显微镜opt=1000 lX-ray =1000.5 但无法偏转不能成像 l目前,光镜最好分辨率opt=0.160.32 m D.结论:利用波长的更短光线做照明光源,可提高分辨率。（OR：波长越短，分辨率越高）电子波波长很短 易于成像，从而导致 电镜的产生和发展2023年5月7日星期日15B.电镜的发展q国外情况1.电镜产生的三大理论基础 Thomson（1897）证明电子的存在 L.de.Broglie(德.1923)提出微观粒子的波粒二 相 性 H.Busch(德.1926)建立几何电子光学理论1)电子的存在l19世纪50年代
9、德.波恩Geissler 2023年5月7日星期日16l1858年,Pluker(德.波恩物理学家),发现阴极射线l1881年,Hertz(赫兹)只认识到阴极射线具有波动性l1897年,Thomson证明阴极射线是带电粒子l其荷质比为1011C/KgB.波粒二相性 法国.L.de.Broglie提出:一个动量为P,能量为E的自由运动的电子,相当于波长为=h/p,频率为V=E/h,并沿着粒子运动方向传播的平面波.电子束既有粒子性电子束既有粒子性,也有波动性也有波动性。2023年5月7日星期日17C.几何电子光学理论 电子光学：指研究和利用电子流的偏转、聚焦、成像规律的一门学科。l1925年，柏林
10、工学院M.knoll 和 A.Matthias尝试做聚焦的电子束透镜l1926年，H.Busch 带有铁轭的短磁透镜聚焦理论lD.gabor(M.knoll 的学生）包壳透镜(1948年提出全息技术 全息技术之父并获诺贝尔奖)l1928-1929,Ernst.Ruska 极靴磁透镜,现代磁透镜B.透射电镜的诞生l1932年，M.Knoll 和他的学生E.Ruska发明了电镜,放大倍数16倍;改进后75Kv,1.2万倍l1939年,西门子制造第一台商品透射电镜l1940年,Helmut.Ruska,研究噬菌体,建立第一个开放实验室l1986年Ernst.Ruska和Gerd.Binnig、Hei
11、nirich.Rothrer获得诺贝尔物理奖2023年5月7日星期日183.扫描电镜的诞生1935年，M.knoll 设计第一台SEM1956年，二次电子探测器出现1956年，SEM商品化1.国内情况1.校外状况vTEM1953年，长春光机所第一台 XD-100型 100kv TEM1965年，中科院科仪厂 DX-2型TEM 100kv 5 1970年，上海新跃仪表厂 DXB1_12型TEM 40万1977年，上海新跃 DXB2_12型TEM 80万 2 vSEM1975年，中科院科仪厂 第一台SEM DX-3 100 DX-5 60 1980年，中科仪 KYKY-1000B1993年，中科仪
12、 KYKY-2000 KYKY-2800 KYKY-2800B KYKY-38002023年5月7日星期日19vSTM(scanning tunneling microscope)1987年，中科仪、中科院化学所白春礼等研制 第一台STM SSX-1型国产电镜的缺点：制造工艺粗燥、自动化程度低、清洁度差q我校情况1980s DX-2型TEM1996年，KYKY-2800型数字式扫描电镜l分辨率6nm，放大倍数10万2023年5月7日星期日201.3 EM分类及特点l透射电镜（TEM）l原理：利用TE，整幅像同时成立，在荧光板上成象l特点：l样品超薄 h1000 l二维平面像、立体感差l分辨率高
13、 opt=2 l样品制备复杂l观察对象：样品内部超微结构l扫描电镜（SEM）l原理：利用SE，逐点成像，显像管上成象l特点：l图象立体感强、可观察一定厚度的样品2023年5月7日星期日21l样品制备简单，可观察较大的样品l分辨率高，3040 l倍率连续可变，从4倍15万倍l可配附件，进行微区的定量、定性分析C.观察对象：样品表面微观结构III.扫描透射电镜（STEM）I.兼顾SEM/TEM的特点、造价高、可观察较厚样品(0.204m)II.分辨率不如TEM高,高分辨型0.30.5nm;附件型1.53nmIII.在200KV时，辐射损伤小、污染小IV.能过检测到扫描透射电子，获取更多超微结构信息
14、V.图像的反差和亮度易调节，切片可以不染色VI.显像方式：荧光屏、显像管 VII.观察对象：表面、内部2023年5月7日星期日22IV.超高压电镜（UHVEM:ultra-high voltage electron microscope）HV500kv为超高压电镜，Hvmax=3MV 其特点：穿透能力强、可观察较厚的样品 m 级分辨率高，2（晶格分辨率）单色性好，色差小，成像质量好辐射损伤小体积庞大、结构复杂、价格昂贵、需专用的防护装置观察对象：主要非生物材料的晶格结构、观察细胞骨架 系统（微梁、微丝）2023年5月7日星期日23E.分析电镜（AEM:analysis electron ele
15、ctron microscope)连续X-ray 背底扣除 能量：Z 特征X-ray的能量 特征X-ray 波长：Z 特征X-ray的波长l波谱仪（WDS）Wavelength-disperse spectrometer 微区定量分析，4Be 92U 慢2060分，灵敏度高B.能谱仪（EDS）Energy-disperse spectrometer 微区定性分析，11Na 92U 快23分，灵敏度低2023年5月7日星期日24VI.低压扫描电镜（LVSEM:low voltage）HV=1Kv，可观察绝缘物质、生物样品 试样不易发生充放电效应VII.生物分析电镜（BATEM:biologic
16、analysis）TEM+EDS（or：WDS）分辨率高=1.5 、分析性能好VIII.扫描隧道显微镜（STM:scanning tunneling microscope）I.M=1000万倍，水平1，垂直0.1 II.可进行“活体”观察、可在大气、液体环境下直接观察物质表面特征III.只能观察导体和半导体的表面结构、非导电的物质需要覆盖一层导电薄膜IV.STM主要用于研究表面科学、半导体材料、生命科学 2023年5月7日星期日25优点：优点：可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤。这些特点适用于研究生物样品和在不同
17、试验条件下对样品表面的评价，例如对于多相催化机理、超导机制、电化学反应过程中电极表面变化的监测等。STM在生物领域的应用：在生物领域的应用：STM在生物和有机材料一领域有着广泛的应用前景。尽管目前还存在着如何解释生物样品的STM图象、如何更好地制备生物样品以及选择合适衬底以沉积生物分子等问题，但实际应用中已取得了不少好结果。例如在真空、大气和溶液条件下的DNA研究，球蛋白、胶原蛋白及红血球的研究等。STM在纳米科技中的应用：在纳米科技中的应用：STM不仅能够对样品表面进行成像，而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰。由微观到宏观，即直接操纵单个原子和分子，对它们进行排列组合，以形成新的物
18、质，或制造出一定功能的机器这是实现纳米加工的新思想，STM的出现使这一思想变为现实。自从STM问世以来，STM作为一种纳米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻写、电子束诱导沉积以及单原子操纵等方面，并取得了一批高水平的研究结果。2023年5月7日星期日26硅硅111面面7 7原子重构象原子重构象 硅片是大家熟悉的制作晶体管和大规模集成电路的半导体材料，为了得到表面清洁的单质材料，要对硅片进行高温加热和退火处理，在加热和退火处理的过程中硅表面的原子进行重新组合，结构发生较大变化，这就是所谓的重构。2023年5月7日星期日27液体中观察原子图象液体中观察原子图象 下图所示的是在电解液中得到的硫酸根离
19、子吸附在铜单晶(111)表面的STM图象。图中硫酸根离子吸附状态的一级和二级结构清晰可见。2023年5月7日星期日28 1990年，IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用35个惰性气体氙原子组成“IBM”三个英文字母。2023年5月7日星期日29 科学家把碳60分子每十个一组放在铜的表面组成了世界上最小的算盘。与普通算盘不同的是，算珠不是用细杆穿起来，而是沿着铜表面的原子台阶排列的.2023年5月7日星期日30 这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图。2023年5月7日星期日31DNA分子拉成的DNA图
20、象2023年5月7日星期日32I.原子力显微镜（AFM：atomic force microscope)A.导电样品、非导电样品均可观察B.分辨率达到原子水平 C.可以在真空、超高真空、电化学环境、常温低温条件下工作D.应用于表面科学、生命科学、材料科学 注：以STM、AFM为基础，衍生出扫描探针显微镜（SPM：Scanning probe microscope）：如激光力显微镜（LFM）、扫描电化学显微镜（SECM）2023年5月7日星期日33X.环境扫描电镜（ESEM）l特点：多种真空状态：高、低、超低真空 1Torr=1mmHg柱压力=1/760大气压=133.3Pa 粗真空：76010
21、乇 低真空：1010-3乇 高真空：10-310-8乇 超高真空：10-8乇以下 多种真空条件下可得SE像、BE像，且=4nm样品室可充气体:水气、氮气动态分析：样品温度从-185 1000 制样简单：样品无须镀膜、脱水干燥真正的“环境”条件，可直接观察含水、含油样品2.缺点：造价太高$30万 Philips低气压空间2023年5月7日星期日341.4 电镜技术的应用l生物科学方面：l细胞生物学l分子生物学l动物学和植物学l微生物学l医学科学l基础医学l临床医学l农林畜牧科学l植物保护l良种繁育（遗传育种）l土壤改良与成分分析l动植物疾病的快速诊断与防治2023年5月7日星期日35 材料科学A
22、.机械部件的疲劳、失效分析B.金属金相学C.建筑材料分析 其他方面：矿产、地质与考古、海关、造纸、电池生 产、物理学与化学、环境保护2023年5月7日星期日361.5 各种显微镜性能与特点的比较 种类照明源透 镜最高分辨率放大倍率焦点深度LM可见光玻璃透镜0.10.2m（紫外显微镜）12000浅(500倍时2 m)TEM电子束电子透镜12（晶格）3（点）10080万中(500倍时500m)SEM电子束电子透镜430100 720万深(500倍时1000m)特征 表一2023年5月7日星期日37 种类视场图象色彩显相方式样品种类样品厚度样品环境LM100mm(1)有直接观察切片、涂片厚（数微米）
23、空气TEM2mm(100)无荧光屏切片、复型膜,涂片极薄1000 真空SEM10mm(10)无显象管各种实体不限真空 续表一 特征2023年5月7日星期日38树立正确的人类认识观lDM机体器官解剖水平（宏观）lLM 细胞细胞水平（微观）lEM 亚细胞分子结构分子水平（超微观）EM的发展趋势l一般形态定量定性lX-ray 分析l电子衍射l俄歇电子能谱l能量分散谱仪l二维平面三维立体图象重组l静态描述动态观察lEM+计算机信息处理2023年5月7日星期日39思考题A.电镜和光镜有何异同？B.你知道有那几类电镜？试简述各自特点及其用途。C.电镜中，可否用X-ray取代电子光源？试分析其原因。2023
24、年5月7日星期日402023年5月7日星期日412023年5月7日星期日422023年5月7日星期日432023年5月7日星期日442023年5月7日星期日452023年5月7日星期日462023年5月7日星期日472023年5月7日星期日482023年5月7日星期日492023年5月7日星期日502023年5月7日星期日512023年5月7日星期日522023年5月7日星期日532023年5月7日星期日542023年5月7日星期日552023年5月7日星期日562023年5月7日星期日572023年5月7日星期日582023年5月7日星期日592023年5月7日星期日602023年5月7日星期日612023年5月7日星期日622023年5月7日星期日632023年5月7日星期日642023年5月7日星期日652023年5月7日星期日662023年5月7日星期日672023年5月7日星期日682023年5月7日星期日692023年5月7日星期日702023年5月7日星期日712023年5月7日星期日722023年5月7日星期日732023年5月7日星期日742023年5月7日星期日752023年5月7日星期日762023年5月7日星期日772023年5月7日星期日782023年5月7日星期日792023年5月7日星期日80
