1、3.1 概述概述3.1.1 色谱法（色谱法（chromatography)的产生的产生l 1906年，俄国植物学家年，俄国植物学家Tswett(次维特）分离植物次维特）分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸碳酸钙粉末钙粉末的玻璃管中，并用的玻璃管中，并用石油醚石油醚自上而下淋洗，自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力吸附力不同，不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到，使各色素成分
2、得到了分离了分离。他将这种分离方法命名为色谱法。他将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。）。柱色谱示意图（柱色谱示意图（column chromatography)固定相？固定相？流动相？流动相？Stationary phase?Mobile phase?现代色谱法（现代色谱法（chromatography)的发展的发展 1931年，德国的年，德国的Kuhn和和Lederer重复了重复了Tswett的的实验，得到很好的结果，色谱法因此得到很大的实验，得到很好的结果，色谱法因此得到很大的推广。推广。1940年，年，Martin和和Synge提出了液提出了液-液分配色谱法，液
3、分配色谱法，又把塔板的概念引入色谱法中，初步建立了塔板又把塔板的概念引入色谱法中，初步建立了塔板理论。理论。1941年，他们提出了用年，他们提出了用气体代替液体做流动相的气体代替液体做流动相的可能性可能性，得了，得了1952年年的诺贝尔化学奖。的诺贝尔化学奖。l20世纪初被发现，世纪初被发现，30年代在实验室成为常年代在实验室成为常规方法；规方法；l20世纪世纪40年代在实验室得到快速发展；年代在实验室得到快速发展；l20世纪世纪50年代建立年代建立气气-液色谱法液色谱法，是现代色，是现代色谱法发展的里程碑，催生了许多现代的色谱法发展的里程碑，催生了许多现代的色谱方法谱方法色谱法（色谱法（ch
4、romatography)的发展的发展A.J.P.MARTIN 和R.L.M.Synge A.J.P.MARTIN.(1910-2002)of the British National Institute for Medical Research shared with fellow countryman R.L.M Synge the Nobel Prize in Chemistry(1952)for the invention of partition chromatography.R.L.M.Synge born Oct.28,1914,Liverpool,Eng.died Aug.18
5、,1994,Norwich,Norfolk.Synge studied at Winchester College,Cambridge,and received his Ph.D.at Trinity College there in 1941.2.2.色谱法的发展历史色谱法的发展历史年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和和g-胡萝卜素。使胡萝卜素。使色谱法开始为人们
6、所重色谱法开始为人们所重视。视。1938Izmailov,Shraiber最先使用最先使用薄层色谱法薄层色谱法。1938Taylor,Uray用用离子交换色谱法离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明提出色谱塔板理论；发明液液-液分配色谱；液分配色谱；预言了气体可作为流动相预言了气体可作为流动相（即（即气相色谱气相色谱）。）。1944Consden等等发明了发明了纸色谱纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段薄层色谱进入实用阶段。1952M
7、artin,James从理论和实践方面完善了从理论和实践方面完善了气气-液分配色谱法液分配色谱法。1956Van Deemter等等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957 基于基于Moore和和Stein的工作，离子交换色谱的氨基酸分析专用仪问世。的工作，离子交换色谱的氨基酸分析专用仪问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础
8、。发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的检测的新型离子色谱法新型离子色谱法。1981Jorgenson等等创立了毛细管电泳法。创立了毛细管电泳法。3.色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代年代获奖学科获奖学科获奖研究工作获奖研究工作19371937化学化学类胡萝卜素化学，维生素类胡萝卜素化学，维生素A A和和B B19381938化学化学类胡萝卜素化学类胡萝卜素化学19391939化学化学聚甲烯和高萜烯化学聚甲烯和高萜烯化学19501950生
9、理学、医学生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离19511951化学化学超铀元素的发现超铀元素的发现19551955化学化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素19581958化学化学胰岛素的结构胰岛素的结构19611961化学化学光合作用时发生的化学反应的确认光合作用时发生的化学反应的确认19701970生理学、医学生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究关于神经元触处迁移物质的研究19701970化学化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用作用19721
10、972化学化学核糖核酸化学酶结构的研究核糖核酸化学酶结构的研究19721972生理学、医学生理学、医学抗体结构的研究抗体结构的研究 3.1.2 色谱法的定义色谱法的定义l 色谱法是一种分离方法，它利用物质在色谱法是一种分离方法，它利用物质在两相两相中中分分配系数的微小差异配系数的微小差异进行分离进行分离。当两相做相对移动。当两相做相对移动时，使被测物质在两相之间进行多次分配，这样时，使被测物质在两相之间进行多次分配，这样原来的微小差异原来的微小差异产生了很大的效果，使各组分分产生了很大的效果，使各组分分离，以达到分离分析及测定一些物理化学常数的离，以达到分离分析及测定一些物理化学常数的目的。目
11、的。l 有两相，流动相和固定相有两相，流动相和固定相气相色谱气相色谱固定相固定相就就是色谱柱里边装的是色谱柱里边装的填料填料，流动相就是，流动相就是气体或者称为载气体或者称为载气气(carrier gas)。l 流动相对固定相做流动相对固定相做连续相对运动连续相对运动，流动相浸透流动相浸透通过固定相；通过固定相；l 被分离的各样品分子（溶质、组分）被分离的各样品分子（溶质、组分）存在差异存在差异，即与流动相和固定相具有不同的作用力即与流动相和固定相具有不同的作用力。色谱分离的共性色谱分离的共性色谱法色谱法（chromatography)意义意义l 色谱法色谱法 又称色层法或层析法，是一种又称色
12、层法或层析法，是一种物理化学物理化学分离分析方分离分析方法；法；l 比任何单一分离技术都有效和普遍，它的出现使分离技术比任何单一分离技术都有效和普遍，它的出现使分离技术上升为上升为“分离科学分离科学”；l 分离效率高，可使性质非常相似很难或不能用萃取、蒸馏分离效率高，可使性质非常相似很难或不能用萃取、蒸馏进行分离的混合物得到分离；进行分离的混合物得到分离；l 目前既是一种分离技术，也是一种分析技术，可同时实现目前既是一种分离技术，也是一种分析技术，可同时实现分离和分析；分离和分析；l 是现代分离科学和分析化学中发展最快，应用最广、潜力是现代分离科学和分析化学中发展最快，应用最广、潜力最大的领域
13、之一。最大的领域之一。3.1.3 色谱法的分类色谱法的分类根据根据流动相状态流动相状态进行一级分类，如气相色谱、液进行一级分类，如气相色谱、液相色谱，然后再根据流动相种类、或固定相种类相色谱，然后再根据流动相种类、或固定相种类等进一步分类，如根据流动相种类，等进一步分类，如根据流动相种类，流动相为超流动相为超临界流体（临界流体（Supercritical Fluid Chromatography），称为超临界流体色谱），称为超临界流体色谱根据根据分离原理分离原理分类，如吸附色谱、分配色谱分类，如吸附色谱、分配色谱、离、离子交换色谱、凝胶色谱、络合色谱、亲和色谱子交换色谱、凝胶色谱、络合色谱、亲
14、和色谱按固定相的外形分类按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱柱色谱。固定相呈平板。固定相呈平板状的色谱法，称为状的色谱法，称为平板色谱平板色谱，它又可分为，它又可分为薄层色谱和纸色谱薄层色谱和纸色谱。根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表。根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表。3.1.4 3.1.4 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语一流出曲线和色谱峰一流出曲线和色谱峰 高斯曲线，对称峰高斯曲线，对称峰二、基线 是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，稳定的基线应该是一条水平直线记录值，稳
15、定的基线应该是一条水平直线.三、峰高三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h h表示，表示，如图如图18183 3中中BA BA 四、保留值四、保留值（1 1）死时间）死时间t tM M 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图如图18 3中中 OA。因为这种物质不被固定相吸。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近相近测定流动相平均线速测定流动相平均线速时
16、，可用柱长时，可用柱长L与与tM的比值计算。的比值计算。MtLu 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图经历的时间，称为保留时间，如图18183 3 OBOB它相应于样品到达柱末端的检测器所需它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间的时间（2 2）保留时间保留时间t tR R（3）保留体积）保留体积 VR 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间t。的关系如下：的关系如下：VR=tRF0 某组份的保留体积扣除
17、死体积后，称该组份的某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即调整保留体积，即 VR=VR-VM 某组份某组份2 2的调整保留值与组份的调整保留值与组份1 1的调整保留值的调整保留值之比，称为相对保留值：之比，称为相对保留值：必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比.六、容量因子六、容量因子k（Capacity factor)MMRtttk容量因子是相对概念，可消除柱长等因素的影响。容量因子是相对概念，可消除柱长等因素的影响。七、选择因子（分离因子）可用符号可用符号表示。表示。在多元混合物分析中，通常在多元混合物分析中，通常选择一选择一对最难分离的对最难分离的物
18、质对物质对，将它们的将它们的作为重要参数作为重要参数 式中式中t tR2R2为后出峰的调整保留时间，所以这时为后出峰的调整保留时间，所以这时 总是大于总是大于1 1的的。1212kkttRR 色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的的函数，它反映了色谱操作条件的动力学动力学因素。度量因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法色谱峰区域宽度通常有三种方法：（1）标准偏差）标准偏差 即即0607倍峰高处色谱峰宽的一半，如倍峰高处色谱峰宽的一半，如图图183中中EF距离的一半。距离的一半。（2）半峰宽）半峰宽W1/2 即峰高一半处对应
19、的峰宽峰高一半处对应的峰宽，如图183中GH间的距离它与标准偏差的关系是：W1/2=2.354 即色谱峰即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图中如图中IJIJ的距离它与标准偏差的关系是：的距离它与标准偏差的关系是：W=4（4）分离度（）分离度（resolution)定量描述相邻两组分在色谱柱内的分离情况的指定量描述相邻两组分在色谱柱内的分离情况的指标。标。1212)(2)(211212WWttWWttRRRRRt tR2,R2,t tR1R1组分的保留时间，组分的保留时间，W W1 1，W W2 2色谱峰底宽，色谱峰底宽，R=1R=1两两峰基本分离，此时峰基
20、本分离，此时t=4t=4;R=1.5 R=1.5两峰完全分离。两峰完全分离。从色谱流出曲线上，得到信息是：从色谱流出曲线上，得到信息是：（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组 份的最少个数份的最少个数 （2）根据色谱峰的保留值）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定或位置），可以进行定性分析性分析 (3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析析 （4）色谱峰的保留值及其区域宽度色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱，是评价色谱柱分离效能的依据柱分离效能的依据 （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相）色谱
21、峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动和流动相相)选择是否合适的依据选择是否合适的依据 l 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远完全分离，两峰间的距离必须足够远，。l 两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。还是不能分开。因此，因此，要要从热力学和动力学两方面来研究色谱从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。行为。一、分配系数K和分配比k1 1分配系数分配系数K K 色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动色谱的分离是基于样品组
22、分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，如吸附色谱的分离是相之间反复多次地分配过程，如吸附色谱的分离是基于反复多次地基于反复多次地吸附吸附/脱附脱附过程。这种分离过程经过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数为分配的参数为分配系数分配系数。它是指在一定温度和压力。它是指在一定温度和压力下，组分在下，组分在固定相和流动相之间固定相和流动相之间分配达平衡时的浓分配达平衡时的浓度之比值，即度之比值，即 2.2.分配比分配比k k(与溶剂萃取一章区分）与溶剂萃取一章区分）分配比又称分配比又称分配容量分配容量或或，它是，它是
23、指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比质量比。即即 msnn量组分在流动相中物质的量组分在固定相中物质的 k k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此称容量大，因此称分配容量分配容量或容量因子或容量因子。它是衡量色谱柱对。它是衡量色谱柱对被被分离组分保留能力分离组分保留能力的重要参数。的重要参数。k k值决定于组分及固定相值决定于组分及固定相热力热力学性质学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相。它不仅随柱
24、温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。及固定相的体积有关。式中式中C CS S，CmCm分别为组分在固定相和流动相的浓度分别为组分在固定相和流动相的浓度；VmVm为柱为柱中流动相的体积，近似等于死体积。中流动相的体积，近似等于死体积。VsVs为柱中固定相的体积，为柱中固定相的体积，在各种不同类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱在各种不同类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，中，VsVs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。相的孔体积。3.分配系数分配系数K与分配比与分配比k的关系的关系 其中称为相比
25、率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为635；对毛细管柱，其值为60600。分配系数分配系数K K 及分配比及分配比k k与选择因子与选择因子的关系的关系 根据对以上公式处理，对根据对以上公式处理，对A A、B B两组分的选择因子，两组分的选择因子，可用下式表示：可用下式表示：)()()()()()(AKBKAkBkAtBtRRl 上式表明：上式表明：两组分的两组分的K或或k值相差越大，则分离得越值相差越大，则分离得越好。因此好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件的先决条件。3.3 样品分子色谱运行的基本特点样品分子
26、色谱运行的基本特点l混合物中混合物中不同样品分子迁移速度不同样品分子迁移速度不同（差不同（差速迁移）；（速迁移）；（differential migration)l同种组分分子在迁移过程中的分布离散同种组分分子在迁移过程中的分布离散(spreading);不同样品分子迁移速度不同样品分子迁移速度差异差异l 由于组分与两相之间的作用力存在差别，使得各由于组分与两相之间的作用力存在差别，使得各组分在两相中的分配系数不同，组分在两相中的分配系数不同，分配系数越大的分配系数越大的组分迁移速度越慢组分迁移速度越慢。l 色谱柱柱温、流动相、固定相的性质影响平衡分色谱柱柱温、流动相、固定相的性质影响平衡分配
27、系数，从而影响各组分的分离。配系数，从而影响各组分的分离。分布离散分布离散(spreading)l 在色谱柱入口处，相同组分分子存在一个在色谱柱入口处，相同组分分子存在一个狭窄的狭窄的区域（区带）区域（区带）内；内；l 在迁移过程中，由于流体分子运动速度的差异，在迁移过程中，由于流体分子运动速度的差异，相同组分分子迁移速度出现差异，相同组分分子迁移速度出现差异，分布区带不断分布区带不断展宽展宽。开管柱和填充柱中压力驱动和开管柱和填充柱中压力驱动和电渗驱动电渗驱动下的流动相输运下的流动相输运柱色谱中溶质的柱色谱中溶质的区带迁移区带迁移方法方法（1）洗脱法：洗脱法：l 流动相和固定相流动相和固定相
28、通常处于平衡状态通常处于平衡状态，样品，样品一次性一次性加在色谱柱一端，流动相加在色谱柱一端，流动相连续通过色谱固定相连续通过色谱固定相将将样品组分一次洗脱出色谱柱；样品组分一次洗脱出色谱柱；l 最方便的、常用的色谱方法，最方便的、常用的色谱方法，分析型色谱分析型色谱均采用均采用此类型；（两相之间的分配不同）此类型；（两相之间的分配不同）（2 2）置换法）置换法：样品样品一次性一次性加到柱上，采用置换剂作为流动相加到柱上，采用置换剂作为流动相连续流经色谱连续流经色谱柱柱，依次将组分置换下来。（置换剂与固定相之间的亲和力，依次将组分置换下来。（置换剂与固定相之间的亲和力比任何组分都强，亲和力弱的
29、先流出，亲和力强的后流出）比任何组分都强，亲和力弱的先流出，亲和力强的后流出）l 制备色谱和工业流程色谱制备色谱和工业流程色谱，达到高通量制备纯化的目的，达到高通量制备纯化的目的（无需浓缩去除溶剂），纯物质的收集可控制在各置换（无需浓缩去除溶剂），纯物质的收集可控制在各置换区带区带的中心区域的中心区域。（3 3）前沿法）前沿法l样品作为流动相或流动相的组成部分连续流经色谱柱样品作为流动相或流动相的组成部分连续流经色谱柱，与固，与固定相亲和力弱的样品组分，首先以纯化合物的形式流出，其次定相亲和力弱的样品组分，首先以纯化合物的形式流出，其次是亲和力较强的第二个组分与第一个组分的混合物，再次是第是亲
30、和力较强的第二个组分与第一个组分的混合物，再次是第二个组分，以此类推。二个组分，以此类推。l前沿法常用于某一组分或混合组分的吸附等温线，以及从主前沿法常用于某一组分或混合组分的吸附等温线，以及从主成分中分离出作用较弱的微量组分，是成分中分离出作用较弱的微量组分，是固相萃取技术固相萃取技术的基础，的基础，很少用于制备分离。（很少用于制备分离。（色谱柱全部被样品污染）色谱柱全部被样品污染）（plate theory）该理论假定：（i）在柱内一小段长度）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度理论塔板高度 H。
31、（ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是而是脉动式脉动式，每次进气为一个塔板体积，每次进气为一个塔板体积（Vm）。）。（iii）所有组分开始时存在于第）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。轴（纵）向扩散可忽略。（iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。板上的量无关。为简单起见，设色谱由为简单起见，设色谱由5块塔板（块塔板（n5，n为柱子的为柱子的塔板数）组成，并以塔板数）组成，并以r表示塔板编号，表示塔板编号，r=
32、1，2，nl；某组分的分配比某组分的分配比k=1.根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：计算如下：开始时，若有单位质量，即开始时，若有单位质量，即m=1m=1（例（例1mg1mg或或1g1g）的该组）的该组分加到第分加到第0 0号塔板上，分配平衡后，由于号塔板上，分配平衡后，由于k=1k=1，即，即n ns s=n=nm m故故n nm m=n=ns s=0.5=0.5。当一个板体积（。当一个板体积（lVlV）的载气以脉动形式进入）的载气以脉动形式进入0 0号板时，就将气相中含有号板时，就将气相中含有n nm m部分组分的载气顶到
33、部分组分的载气顶到1 1号板上，号板上，此时此时0 0号板液相（或固相）中号板液相（或固相）中n ns s部分组分及部分组分及1 1号板气相中的号板气相中的n nm m部分组分，将各自在两相间重新分配。故部分组分，将各自在两相间重新分配。故0 0号板上所含组分号板上所含组分总量为总量为0.50.5，其中气液（或气固）两相各为，其中气液（或气固）两相各为0.250.25而而1 1号板上号板上所含总量同样为所含总量同样为0.50.5气液（或气固）相亦各为气液（或气固）相亦各为0.250.25。以后。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上
34、述过程就重复一次程就重复一次(见下表见下表)。按上述分配过程，对于按上述分配过程，对于n=5n=5，k=1k=1，m=1m=1的体系，的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，由塔板理论可由塔板理论可建流出曲线方程建流出曲线方程：m为组分质量，为组分质量，Vr为保留体积，为保留体积，n为理论塔板数。当流为理论塔板数。当流动相体积动相体积V=Vr 时，时，C值最大，即值最大，即 色谱柱长：色谱柱长：L L，虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：H H，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n n，则三者的关系为：则三者的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
35、理论塔板数与色谱参数之间的关系为：221/25.54()16()RRttnWW l 从上两式可以看出，色谱峰从上两式可以看出，色谱峰W越小，越小，n就越大，而就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，就越小，柱效能越高。因此，n和和H是描述柱效是描述柱效能的指标。能的指标。l 通常通常填充色谱柱的填充色谱柱的n103，H1mm。而毛细管。而毛细管柱柱 n=105-106，H0.5mml 由于死时间由于死时间tM包括在包括在tR中中,而实际的而实际的tM不参与柱内不参与柱内分配分配,因而虽然计算的因而虽然计算的n值很大值很大,H很小很小,但与实际柱但与实际柱效能相差甚远。所以效能相差甚远。所以,提出
36、提出把把tM扣除扣除,采用采用 222/1)(16)(54.5wtwtnrreffeffeffnLH塔板理论的特点和不足塔板理论的特点和不足 (1)当色谱柱长度一定时，当色谱柱长度一定时，塔板数塔板数 n 越大越大(塔板高度塔板高度 H 越越小小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高柱效能则越高，所，所得色谱峰越窄。得色谱峰越窄。(2)(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定应指明测定物质。物质。(3)
37、(3)柱效不能表示柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分被分离组分的实际分离效果，当两组分的的分配系数分配系数K K相同时，相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。离。(4)(4)塔板理论塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下下柱柱效不同效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。的途径。3.6 速率理论速率理论（1）涡流扩散）涡流扩散：在填充柱色谱中，粒径填料之间的间隙是流动相在填充柱色谱中，粒径填料之间的间隙是流动相流动的通路。由于填料粒径、
38、形状及填充柱床的流动的通路。由于填料粒径、形状及填充柱床的不均一性都会使填充柱形成宽窄、长短不同的路不均一性都会使填充柱形成宽窄、长短不同的路径径.l 流动相因不同路径的流速差异而引起的溶质分布流动相因不同路径的流速差异而引起的溶质分布区带扩展，称为涡流扩散（区带扩展，称为涡流扩散（eddy diffusion)效应或效应或称多路径效应称多路径效应(multiple paths)Hm。表征粒子填充不均匀的常数项，称为填充不均表征粒子填充不均匀的常数项，称为填充不均匀因子，通常接近于匀因子，通常接近于1，它与粒径分布有关，它与粒径分布有关，粒粒径分布越窄，分布越均匀，径分布越窄，分布越均匀，值越
39、小值越小；dp为填料为填料粒径。粒径。PMdH2(2)(2)纵向扩散纵向扩散（HL)l 当一定浓度的溶质进入色谱柱后，溶质便会因为浓度梯当一定浓度的溶质进入色谱柱后，溶质便会因为浓度梯度而向周围的流动相内扩散，如果度而向周围的流动相内扩散，如果进样口处的谱带是柱塞进样口处的谱带是柱塞形形的，扩散的结果是的，扩散的结果是向流动相的运动方向扩散向流动相的运动方向扩散，即，即纵向扩纵向扩散散，造成谱带展宽，这种扩散称为纵向扩散（，造成谱带展宽，这种扩散称为纵向扩散（longitudinal diffusion).l 纵向扩散是由分子的纵向扩散是由分子的无规则运动无规则运动引起，又称为分子扩散。引起，
40、又称为分子扩散。纵向扩散纵向扩散(HL)=溶质在流动相中纵向扩散溶质在流动相中纵向扩散HL(m)+溶溶质在固定相中的纵向扩散质在固定相中的纵向扩散HL(s)mSmsmLDDkDDDH12121);1(222Dm,Ds溶质在流动相和固定相中的扩散系数溶质在流动相和固定相中的扩散系数;流动相流动相的线速度；的线速度；扩散阻碍因子或扩散阻碍因子或填料因子填料因子，因填料不均匀性，因填料不均匀性对扩散影响而引入的校正值，对于填充柱通常对扩散影响而引入的校正值，对于填充柱通常 1；对于；对于开管毛细管柱，不存在路径弯曲，因而无扩散阻碍，开管毛细管柱，不存在路径弯曲，因而无扩散阻碍，=1。影响纵向扩散的因
41、素影响纵向扩散的因素l HL与扩散系数成正比，与流速的线速度成反比；与扩散系数成正比，与流速的线速度成反比；l 通常溶质在气相中扩散系数远大于在液相中的扩通常溶质在气相中扩散系数远大于在液相中的扩散系数，散系数，Dm 104105,HL对于气相色谱纵向扩散对于气相色谱纵向扩散非常重要，非常重要，l 对于高效液相色谱只要对于高效液相色谱只要流速较高流速较高，纵向扩散，纵向扩散HL对对总理论塔板高度的贡献总理论塔板高度的贡献 E时，即为时，即为Van Deemter 方程；当方程；当E ，E/时，时，A/(1+E/)0,因流速的急速降低，多路因流速的急速降低，多路径的影响可忽略不计了。径的影响可忽
42、略不计了。思考思考:l 液相色谱可通过使用液相色谱可通过使用细粒径颗粒细粒径颗粒、高柱压操作、低粘度流、高柱压操作、低粘度流动相动相(提高柱温、加入提高柱温、加入CO2)达到最好的分离效果。达到最好的分离效果。l 液相色谱溶质在流动相中的扩散慢（液相色谱溶质在流动相中的扩散慢（扩散系数小），扩散系数小），可通可通过采用比常规气相色谱低得多的流速来弥补比气相色谱低过采用比常规气相色谱低得多的流速来弥补比气相色谱低的柱效。的柱效。l 非多孔填料最大限度地减小了因填料颗粒内传质慢而引起非多孔填料最大限度地减小了因填料颗粒内传质慢而引起的柱效降低，但因的柱效降低，但因表面积减小，溶质分子的保留值减小表
43、面积减小，溶质分子的保留值减小，不利于优化小分子的分离，但对不利于优化小分子的分离，但对大分子影响大分子影响较小（大分子较小（大分子比小分子扩散系数小低比小分子扩散系数小低1-2个数量级）。个数量级）。3.4 折合参数折合参数l 采用折合参数（h,?)代替绝对参数以比较不同类型色谱柱的柱效，如在不同颗粒填料、不同黏度流动相、不同扩散系数溶质的相互间比较。l h折合塔板高度；l 折合流动相流速；l 柱流动阻抗因子。2)(44.51RhpptWdLdHhmmpmpDtdLDddp固定相颗粒的直径，固定相颗粒的直径，Wh半峰宽；半峰宽；tR溶质的保留时间，溶质的保留时间，h板间所含颗粒数，与颗粒大小
44、无关板间所含颗粒数，与颗粒大小无关.D Dm m溶质在流动相中的扩散系数；溶质在流动相中的扩散系数；t tR R死时间。死时间。表示流动相表示流动相以粒间扩散速度为单位的流速；以粒间扩散速度为单位的流速；2202Ltpdkdmppp柱压降；柱的比透过度，柱压降；柱的比透过度，?用于表示不同粒度填充柱的渗透用于表示不同粒度填充柱的渗透性和填装的密度，多孔填料性和填装的密度，多孔填料?在在250650之间，假如数值很高之间，假如数值很高（正常值的（正常值的10倍）说明色谱系统部分受阻，所以倍）说明色谱系统部分受阻，所以?越小越好。越小越好。折合板高与折合流速的关系为：折合板高与折合流速的关系为：C
45、BAh3/1此为折合板高方程，用于比较不同粒度填料的柱效能。此为折合板高方程，用于比较不同粒度填料的柱效能。B/v B/v 表示表示纵向扩散纵向扩散产生的折合板高；产生的折合板高；AvAv1/31/3,表示由偶合表示由偶合涡流涡流引起引起的折合板高；的折合板高；CvCv表示由流动相和固定相之间的慢传质引起的表示由流动相和固定相之间的慢传质引起的折合板高折合板高;A,B,CA,B,C为常数为常数，与柱的填充好坏有关，与粒径大小与柱的填充好坏有关，与粒径大小无关。无关。2)(44.51RhpptWdLdHhmmpmpDtdLDdCBAh3/1求出求出求出求出对作图，求出，对作图，求出，常数常数A主
46、要表示柱填充的好坏，主要表示柱填充的好坏，A 一般在一般在0.51之间，之间，A 2表表示柱填充有问题；示柱填充有问题；B反映柱中洗脱剂的路径以及由于填料的存反映柱中洗脱剂的路径以及由于填料的存在而阻碍溶质扩散的程度，在而阻碍溶质扩散的程度，B要求小于，约为最好；要求小于，约为最好；C表表示溶质在流动相合固定相之间质量转移的效能，折合流速较高示溶质在流动相合固定相之间质量转移的效能，折合流速较高时，其贡献较大，薄可填料时，其贡献较大，薄可填料C，对多孔填料数值较大，一般，对多孔填料数值较大，一般0.05较为合适。较为合适。l 折合参数及其折合参数及其lglgh h -lg-lgv v图是目前广
47、泛用来表示柱图是目前广泛用来表示柱效能的一种方法，它与填充材料的粒度大小无关，效能的一种方法，它与填充材料的粒度大小无关，在实际过程中用于比较不同粒度填充的色谱柱的在实际过程中用于比较不同粒度填充的色谱柱的效能，并可效能，并可使用统一的标准来衡量柱的质量使用统一的标准来衡量柱的质量。3.5 柱外效应柱外效应（连接管路）进样）（色谱柱）（总）2222(tuincoT（其它因素）（检测器）22ordel除了第一项外，其它引起色谱峰扩展的因素均称为除了第一项外，其它引起色谱峰扩展的因素均称为柱外柱外效应。效应。l气相色谱柱体积较大，柱外效应一般较小；液相色谱色气相色谱柱体积较大，柱外效应一般较小；液
48、相色谱色谱柱体积小溶质扩散系数很低，柱外效应对色谱区带的扩谱柱体积小溶质扩散系数很低，柱外效应对色谱区带的扩展影响不可忽略。展影响不可忽略。l进样进样 进样是柱外效应引起色谱峰扩展的一个主要原因。进样是柱外效应引起色谱峰扩展的一个主要原因。典型进样方式：塞子型和指数型。典型进样方式：塞子型和指数型。指数型进样在指数型进样在进样系统死体积过大时进样系统死体积过大时出现，此时样品在柱出现，此时样品在柱头上的浓度可用指数衰减型函数表示。头上的浓度可用指数衰减型函数表示。SternbergSternberg提出以体积表示为：提出以体积表示为：22121ininV进样体积越大，引起的柱外效应越大。进样体
49、积越大，引起的柱外效应越大。3.6 3.6 等温线的影响等温线的影响l 在分析型色谱分离条件下，溶质的分配系数与其在分析型色谱分离条件下，溶质的分配系数与其浓度无关，溶质在固定相中的浓度对其在流动相浓度无关，溶质在固定相中的浓度对其在流动相中浓度作图是一条直线，斜率为分配系数，该图中浓度作图是一条直线，斜率为分配系数，该图是在等温条件下获得的，故称之为等温线。是在等温条件下获得的，故称之为等温线。l 线性等温线得到线性等温线得到对称色谱峰对称色谱峰，其峰宽取决于色谱，其峰宽取决于色谱柱的动力学性质，是线性色谱的基础。柱的动力学性质，是线性色谱的基础。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线如
50、果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用性范围内，色谱峰如果对称，可用GaussGauss正态分布正态分布函数表示：函数表示：式中：式中：CC不同时间不同时间t t时某物质的浓度，时某物质的浓度，C C0 0进样浓进样浓度，度，t tr r保留时间，保留时间，标准偏差标准偏差。3.7 3.7 分离度与色谱特性分离度与色谱特性l 色谱分离中常称两相邻色谱组分为色谱分离中常称两相邻色谱组分为“物质对物质对”，混合物分离，混合物分离条件的选择，主要是提高最难分离物质对的分离度。实际过条件的选择，主要是提高最难分离物质对的分离度。实际过程中测量分离度用如下公式：程中测量分
