1、第四章第四章 食品检验检疫新技术食品检验检疫新技术 第一节第一节 免疫学检测技术免疫学检测技术1.1.基本概念基本概念抗原：凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，抗原：凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。为抗原。抗体：在抗原刺激下产生的，并能与之特异性抗体：在抗原刺激下产生的，并能与之特异性结合的免疫球蛋白。结合的免疫球蛋白。血清学试验：抗原抗体在体外发生的特异性结血清学试验：抗原抗体在体外发生的特异性结合反应、抗原抗体的反应一般都要用血清，合反应、抗原抗体的反应一般都要用血清，故称为血清学试验或血清学反应。故称
2、为血清学试验或血清学反应。免疫学检测方法的原理：是借助抗原和抗免疫学检测方法的原理：是借助抗原和抗体在体外特异性结合后出现的各种现象，对体在体外特异性结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定量或定性的检测。标本中的抗原或抗体进行定量或定性的检测。可以作为抗原进行检测的物质分为以下四可以作为抗原进行检测的物质分为以下四类：类：各种微生物及其大分子产物；各种微生物及其大分子产物；生物体内各种大分子物质；生物体内各种大分子物质；人和动物细胞的表面分子；人和动物细胞的表面分子；各种半抗原物质。各种半抗原物质。酶联免疫吸附试验是在免疫酶技术的基础上发展起酶联免疫吸附试验是在免疫酶技术的基础上发展
3、起来的一种新型的免疫测定技术，其基本原理是抗体来的一种新型的免疫测定技术，其基本原理是抗体（抗原）与酶结合后，仍能和相应的抗原（抗体）发（抗原）与酶结合后，仍能和相应的抗原（抗体）发生特异性反应，将待检测样品事先吸附在固相载体表生特异性反应，将待检测样品事先吸附在固相载体表面称为包被；加入酶标抗体（抗原），酶标抗体（抗面称为包被；加入酶标抗体（抗原），酶标抗体（抗原），与吸附在固相载体上的相应的抗原（抗体）发原），与吸附在固相载体上的相应的抗原（抗体）发生特异性反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓生特异性反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓冲液洗掉；当加入酶的底物时，底物发生化学反应，冲液
4、洗掉；当加入酶的底物时，底物发生化学反应，呈现颜色变化，颜色的深浅与待测抗原或抗体的量相呈现颜色变化，颜色的深浅与待测抗原或抗体的量相关，借助分光光度计的吸光度计算抗原（抗体）的量，关，借助分光光度计的吸光度计算抗原（抗体）的量，也可用肉眼定性观察。也可用肉眼定性观察。抗原抗体的特异性和敏感性，使得食品在未经分抗原抗体的特异性和敏感性，使得食品在未经分离提取的条件下，即可进行定量和定性分析，而一离提取的条件下，即可进行定量和定性分析，而一般的化学分析都需要经过分离提取等复杂过程。近般的化学分析都需要经过分离提取等复杂过程。近年来，该项技术主要用于细菌及毒素、真菌及毒素、年来，该项技术主要用于细
5、菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫的检测；用于蛋白质、激素、其他生病毒和寄生虫的检测；用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、兽药残留、农药残留、抗生素等的检理活性物质、兽药残留、农药残留、抗生素等的检测。测。第二节第二节 核酸提取方法与探针技术核酸提取方法与探针技术 样品增菌后的核酸提取方法：样品增菌后的核酸提取方法：热裂解法热裂解法 反复冻融法反复冻融法 酶裂解法酶裂解法 微波法微波法 化学裂解法化学裂解法 超声破碎法超声破碎法样品无需增菌的核酸提取方法：样品无需增菌的核酸提取方法：IMSIMS法（免疫磁珠法）法（免疫磁珠法）FTAFTA滤膜吸附法滤膜吸附法病毒核酸的提取：病毒核酸的提取：异硫
6、氰酸胍异硫氰酸胍-SiO2-SiO2法：异硫氰酸胍可以裂解细胞壁，法：异硫氰酸胍可以裂解细胞壁，并灭活核酸酶，释放出来的核酸被经处理的并灭活核酸酶，释放出来的核酸被经处理的SiO2SiO2所吸附，所吸附，从而达到纯化目的。从而达到纯化目的。Glycine-PEG-Tri-reagent-poly(dT)Glycine-PEG-Tri-reagent-poly(dT)法：通过调节法：通过调节PHPH和和PEGPEG沉淀核酸，再用沉淀核酸，再用poly(dT)poly(dT)纯化核酸。纯化核酸。探针的标记物分类：探针的标记物分类：放射性同位素放射性同位素非放射性标记物：是通过酶促反应将特定的非放射
7、性标记物：是通过酶促反应将特定的底物转变为声色物质或化学发光物而达到放大底物转变为声色物质或化学发光物而达到放大信号的目的。常用的标记物金属、荧光染料、信号的目的。常用的标记物金属、荧光染料、地高辛、生物素和酶等，可通过酶促反应、光地高辛、生物素和酶等，可通过酶促反应、光促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。探针技术探针技术探针的标记方法：探针的标记方法：缺口平移法缺口平移法随机引物法随机引物法末端标记法末端标记法PCRPCR标记法标记法第三节第三节 PCR PCR检测技术检测技术PCRPCR即聚合酶链反应的简称。即聚合酶链反应的简称。PCR PCR是
8、在体外是在体外模拟模拟DNADNA复制的过程，在体外合适的条件下以复制的过程，在体外合适的条件下以单链单链DNADNA为模板，以人工设计和合成的寡核苷为模板，以人工设计和合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的酸为引物，利用热稳定的DNADNA聚合酶延聚合酶延5-35-3方向渗入单核苷酸来特异性的扩增方向渗入单核苷酸来特异性的扩增DNADNA片段的片段的技术。整个反应过程通常由技术。整个反应过程通常由20-4020-40个个PCRPCR循环循环组成，每个循环由变性、退火、延伸三个步骤组成，每个循环由变性、退火、延伸三个步骤组成。组成。PCRPCR的种类：的种类：（1 1）多重）多重PCRPCR（2
9、2）免疫）免疫PCRPCR（3 3）PCR-SSCP PCR-SSCP分析技术分析技术（4 4）实时荧光定量）实时荧光定量PCRPCR（5 5）反转录）反转录PCRPCR（6 6）不对称）不对称PCRPCR（7 7）反向）反向PCRPCRPCRPCR检测技术的应用：检测技术的应用：（1 1）检测产单核细胞李斯特菌）检测产单核细胞李斯特菌（2 2）检测金黄色葡萄球菌）检测金黄色葡萄球菌（3 3）检测沙门氏菌）检测沙门氏菌（4 4）检测致泻大肠杆菌）检测致泻大肠杆菌第四节第四节 基因芯片技术基因芯片技术基因芯片又称基因芯片又称DNADNA微阵列，是指由按微阵列，是指由按照预定位置固定在固相载体上很
10、小面积照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所构成的微点阵阵内的千万个核酸分子所构成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的互补核酸片段杂交。可以与来自样品的互补核酸片段杂交。如果把样品中的核酸点段进行标记，在如果把样品中的核酸点段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。信号。基因芯片技术可以应用于转基因食品基因芯片技术可以应用于转基因食品的检测中。的检测中。基因芯片的分析步骤基因芯片的分析步骤(1)(1)样品活化样品活化(2)(2)靶靶DNADNA的选择的选择(3)PCR(3)P
11、CR扩增扩增(4)(4)玻片的活化玻片的活化(5)(5)芯片的制备芯片的制备(6)(6)杂交杂交(7)(7)洗涤洗涤(8)(8)扫面玻片和数据处理扫面玻片和数据处理 检测转基因食品基因芯片的制备方法：检测转基因食品基因芯片的制备方法：选择目的片段选择目的片段 根据食品原料来源的具体情况选择不同根据食品原料来源的具体情况选择不同基因或其片段作为检测对象，分别设计扩增引物，基因或其片段作为检测对象，分别设计扩增引物，PCRPCR扩扩增获得探针，将探针纯化，浓缩后点样于固相支持物上。增获得探针，将探针纯化，浓缩后点样于固相支持物上。转基因食品转基因食品DNADNA的提取的提取目的片段的扩增和标记目的
12、片段的扩增和标记杂交和洗涤杂交和洗涤杂交结果的检测：以基因芯片扫描仪在一定波长进行扫杂交结果的检测：以基因芯片扫描仪在一定波长进行扫描检测。描检测。第五节第五节 生物传感器生物传感器 生物传感器由一种含有固定化生生物传感器由一种含有固定化生物活性物质（如酶、抗体、全细胞、物活性物质（如酶、抗体、全细胞、细胞器或其他联合体）做敏感元件，细胞器或其他联合体）做敏感元件，配上适当的换能器所构成的分析工配上适当的换能器所构成的分析工具（或分析系统）称为生物传感器。具（或分析系统）称为生物传感器。它可将生化信号转化为数量化的电它可将生化信号转化为数量化的电信号。信号。生物传感器一般由两个主要部分组成：一
13、是生物生物传感器一般由两个主要部分组成：一是生物分子识别元件（感受器），是具有分子识别能力的生分子识别元件（感受器），是具有分子识别能力的生物活性物质（如酶、抗体、组织切片、细胞、细胞器、物活性物质（如酶、抗体、组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、核酸、有机物分子等）；二是信号转换器细胞膜、核酸、有机物分子等）；二是信号转换器（换能器）主要有电化学电极、光学检测元件、热敏（换能器）主要有电化学电极、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振元件等。振元件等。当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生当待测物与分子识别元件特异性结
14、合后，所产生的复合物通过信号转换器转变为可以输出的电信号、的复合物通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目地。光信号等，从而达到分析检测的目地。生物传感器的工作原理生物传感器的工作原理（1 1）将化学变化转变成电信号）将化学变化转变成电信号（2 2）将热变化转换成电信号）将热变化转换成电信号（3 3）将光信号转变为电信号）将光信号转变为电信号（4 4）直接产生电信号形式）直接产生电信号形式常见的生物传感器及其应用常见的生物传感器及其应用酶传感器：酶传感器是由固定化酶和电化酶传感器：酶传感器是由固定化酶和电化学器件构成，通过电极反应检测出与酶反应学器件构成，通过电极反
15、应检测出与酶反应有关的物质，并转换为电信号，从而检测试有关的物质，并转换为电信号，从而检测试液中的特定成分的浓度。酶传感器是间接型液中的特定成分的浓度。酶传感器是间接型传感器，他不是直接测量待测物质，而是通传感器，他不是直接测量待测物质，而是通过与反应有关的物质间接地测量待测物质。过与反应有关的物质间接地测量待测物质。常见的生物传感器及其应用常见的生物传感器及其应用组织感器：是以动植物组织薄片中的生物组织感器：是以动植物组织薄片中的生物催化层与基础敏感膜电极结合而成，该催化催化层与基础敏感膜电极结合而成，该催化层以酶为基础，基本原理与酶传感器相同。层以酶为基础，基本原理与酶传感器相同。常见的生
16、物传感器及其应用常见的生物传感器及其应用微生物传感器微生物传感器 微生物传感器由包括微生物微生物传感器由包括微生物的膜状感受器和电化学换能器组合而成，可以的膜状感受器和电化学换能器组合而成，可以分为：以微生物呼吸活性（氧消耗量）为指标分为：以微生物呼吸活性（氧消耗量）为指标的呼吸活性测定型传感器，以微生物的代谢产的呼吸活性测定型传感器，以微生物的代谢产物（电极活性物质）为指标的电极活性物质测物（电极活性物质）为指标的电极活性物质测定型传感器。定型传感器。微生物传感器在食品工业和环境检测中均微生物传感器在食品工业和环境检测中均有应用。有应用。免疫传感器：利用抗体能够识别抗原并和被识别抗原免疫传感
17、器：利用抗体能够识别抗原并和被识别抗原结合的功能，借此开发的生物传感器为免疫传感器。免结合的功能，借此开发的生物传感器为免疫传感器。免疫传感器是以免疫测定法的原理为基础构成的，可分为疫传感器是以免疫测定法的原理为基础构成的，可分为标识免疫方式和非标识免疫方式。可以识别肽或蛋白质标识免疫方式和非标识免疫方式。可以识别肽或蛋白质等高分子之间微小的结构差异。等高分子之间微小的结构差异。免疫传感器的应用：免疫传感器的应用：（1 1）检测食品中的毒素）检测食品中的毒素 毒素的检测主要集中在伏马毒素的检测主要集中在伏马菌素、葡萄球菌肠毒素、黄曲霉毒素、肉毒毒素等上，菌素、葡萄球菌肠毒素、黄曲霉毒素、肉毒毒
18、素等上，所用传感器大多数采用光纤免疫传感器。所用传感器大多数采用光纤免疫传感器。（2 2）检测食品中的细菌）检测食品中的细菌 以电化学为基础的免疫传感以电化学为基础的免疫传感器已成功用于检测细菌毒素蛋白质。器已成功用于检测细菌毒素蛋白质。DNADNA生物传感器生物传感器 DNA DNA生物传感器包括两部分，分生物传感器包括两部分，分子识别器件（子识别器件（DNADNA）和换能器。其设计原理是在电极）和换能器。其设计原理是在电极上固定一条含有十几至上千条核苷酸的单链上固定一条含有十几至上千条核苷酸的单链DNADNA，通，通过过DNADNA分子杂交，对另一条含有互补碱基序列的分子杂交，对另一条含有互补碱基序列的DNADNA进行识别，结合成双连进行识别，结合成双连DNADNA。杂交反应在敏感元件上。杂交反应在敏感元件上直接完成，换能器能将杂交过程所产生的变化转变成直接完成，换能器能将杂交过程所产生的变化转变成电信号。根据杂交前后电信号的变化量，推测出被检电信号。根据杂交前后电信号的变化量，推测出被检测的测的DNADNA量。量。DNADNA生物传感器的应用：应用于细菌病、病毒病、生物传感器的应用：应用于细菌病、病毒病、中毒病、肿瘤病等疾病的检测方面。中毒病、肿瘤病等疾病的检测方面。
