1、蛋白质和氨基酸的测定主讲教师：江苏农林职业技术学院 李静农产品/食品理化分析技术 3 蛋白质基础知识1 1蛋白质的测定方法2 2氨基酸基础知识3 3 氨基酸的测定方法4 4目录页CONTENTS PAGE 4 2蛋白质的测定方法蛋白质测定的基本原理蛋白质的测定方法凯氏定氮法过渡页TRANSITION PAGE 5 一、蛋白质测定的基本原理蛋白质测定方法1.基本原理2.测定方法3.凯氏定氮法根据蛋白质的性质和成分，其测定的基本原理主要有以下两个方面：利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。蛋白质测定的基本原
2、理 6 二、蛋白质的测定方法蛋白质测定方法蛋白质的测定方法1.基本原理2.测定方法3.凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法双缩脲法双缩脲法（Biuret法）法）紫外分光光紫外分光光度计法度计法酚试剂法酚试剂法（Lowry法法）考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法适用于适用于0.2 1.0mg氮氮,误误差差为为 2,用于用于标准蛋标准蛋白质含量的准确测定；白质含量的准确测定；干扰干扰少少,灵敏度低灵敏度低,费时长费时长。较较快速快速，不同蛋白质不同蛋白质产生产生颜色深浅颜色深浅相近相近，干扰，干扰物质物质少，灵敏度少，灵敏度差差。常用。常用于需于需要快速，但并不需要十分要快速，但并不需要十分精确的蛋白质精确的蛋白
3、质测定。测定。简便简便、灵敏灵敏、快速、不消、快速、不消耗耗样品样品,准确度准确度较差，干扰较差，干扰物质多。适用于测定与标物质多。适用于测定与标准准Pro.组成相似的蛋白质组成相似的蛋白质。灵敏度高灵敏度高，比双缩脲法灵敏比双缩脲法灵敏得多，费时间较长，要精确得多，费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多一性较差，干扰物质较多。灵敏度高，测定快速简便，灵敏度高，测定快速简便，干扰物质少。由于各种蛋干扰物质少。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同用于不氨基酸的含量不
4、同用于不同蛋白质测定时有较大的同蛋白质测定时有较大的偏差。偏差。7 三、凯氏定氮法蛋白质测定方法（一）凯氏定氮法的原理1.基本原理2.测定方法3.凯氏定氮法消化消化蒸馏蒸馏吸收吸收滴定滴定样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。将消化好的样品加碱蒸馏，使氨蒸出。用硼酸溶液吸收氨气。再用标准酸溶液滴定,根据酸的消耗量计算。8 三、凯氏定氮法蛋白质测定方法（二）器材与试剂1.基本原理2.测定方法3.凯氏定氮法1主要器材：主要器材：消化管、消化管、消化炉、定氮仪、酸式消化炉、定氮仪、酸式滴定管、铁架台、蝶形滴定管
5、、铁架台、蝶形夹、锥形瓶等。夹、锥形瓶等。2试剂：试剂：浓硫酸、硫酸浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、铜、硫酸钾、NaOH溶液溶液 400g/L、HCL标准溶液标准溶液 0.1mol/L或或0.01mol/L、硼酸溶液硼酸溶液40g/L、甲基红、甲基红-溴甲酚绿指示剂（溴甲酚绿指示剂（2g/L）5:1）9 三、凯氏定氮法蛋白质测定方法（三）操作方法1.基本原理2.测定方法3.凯氏定氮法1.1.取样取样取样量0.22.0g固体样品固体样品取样量2.05.0g半固体样品半固体样品取样量10.020.0mL液体样品液体样品于干燥洁净的消化管内 10 三、凯氏定氮法蛋白质测定方法（三）操作方法1.基本原理2.测
6、定方法3.凯氏定氮法2.2.消化消化 将消化管放入消化炉，先采用低温加热(180左右)，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，提高消化温度(370420)，保持消化管内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h1h，取下放冷。同时做试剂空白试验。1、加入称量好的样品2、加入催化剂（CuSO4与K2SO4的混合物，1:20）3、加入浓硫酸 11 三、凯氏定氮法蛋白质测定方法（三）操作方法1.基本原理2.测定方法3.凯氏定氮法3.3.蒸蒸馏馏与与吸吸收收碱液硼酸蒸馏水样品加水稀释接收瓶内加入硼酸碱液加入消化管开始蒸馏氨被蒸出循环水冷凝氨被吸收 12 三、凯氏定氮法蛋白质测定方法（三）操作方
7、法1.基本原理2.测定方法3.凯氏定氮法4.4.滴定滴定硼酸吸收液蒸馏滴定加入指示剂后溶液为蓝色蓝色指示剂滴定后溶液为微红色微红色标准酸 13 三、凯氏定氮法蛋白质测定方法（四）结果计算1.基本原理2.测定方法3.凯氏定氮法X样品蛋白质含量，g/100g；V1样品滴定消耗标准HCl溶液的体积，mL；V2空白滴定消耗标准HCl溶液的体积，mL；C标准HCl滴定溶液的浓度，mol/L；0.0141mL盐酸c(HCl)=1.000 mol/L标准滴定液相当于氮的质量，g；m样品的质量，g；F氮换算为蛋白质的系数。12()0.014100VVCXFm-创=创 14 三、凯氏定氮法蛋白质测定方法（五）注意事项1.基本原理2.测定方法3.凯氏定氮法1、取样量较大时，消化时每克试样增加5ml H2SO4的量；2、蒸馏前若加碱量不足，消化液不生成Cu(OH)2沉淀，增加碱用量；3、消化时，若样品含糖高或含脂较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生；4、硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。常量凯氏定氮法测定蛋白质含量时需要说明的问题及注意事项如下：
