1、第四章第四章 发酵工业的无菌技术发酵工业的无菌技术第一节第一节 发酵工业污染的防治发酵工业污染的防治第二节第二节 发酵培养基及设备管道灭菌发酵培养基及设备管道灭菌第三节第三节 空气除菌空气除菌 纯种培养要求必须防止杂菌污染纯种培养要求必须防止杂菌污染 为防止染菌，采取了一系列措施：为防止染菌，采取了一系列措施：密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作；备灭菌、无菌操作；染菌无法彻底避免；据报道：染菌无法彻底避免；据报道：国外抗生素发酵染菌率为国外抗生素发酵染菌率为25%，国内抗生素发酵、，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为青霉素发酵
2、的染菌率为2，链霉素、红霉素和四环素，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体感染率为，谷氨酸噬菌体感染率为12。染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。第一节第一节 发酵工业污染的防治发酵工业污染的防治一、污染的危害一、污染的危害1、染菌的不良后果、染菌的不良后果 消耗营养消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变改变pH 分解产物分解产物 噬菌体破坏极大噬菌体破坏极大2.染菌危害的具体分析染菌危害的具体分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响）染菌对不同菌种发酵的影响A细
3、菌细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。杂菌，但噬菌体威胁大。肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。产物。B.霉菌霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发迅速破坏，发酵一无所获。酵一无所获。柠檬酸：柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。，不易染菌，主要防止前期染菌。C.酵母菌酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌。D.疫苗：无
4、论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。应全部废弃。（2）染菌种类对发酵的影响染菌种类对发酵的影响l 青霉素：怕染细短产气杆菌青霉素：怕染细短产气杆菌l 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌l 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌l 柠檬酸：怕染青霉菌柠檬酸：怕染青霉菌l 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌l 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响）不同发酵时期染菌对发酵的影响种子扩
5、大时期染菌种子扩大时期染菌:灭菌后弃去。灭菌后弃去。发酵前期染菌发酵前期染菌：应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种。应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种。发酵中期染菌：危害极大、挽救困难，应早发现，快处发酵中期染菌：危害极大、挽救困难，应早发现，快处理理 ，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。定。抗生素发酵抗生素发酵：输入正常发酵已产抗生素的发酵液。：输入正常发酵已产抗生素的发酵液。柠檬酸发酵：柠檬酸发酵：a.污染细菌：加大通风，加速产酸，调污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑，抑制细菌制细菌。b.污染酵母：加入污
6、染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母；通抑制酵母；通风加大，加速产酸。风加大，加速产酸。c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，下降，黄曲霉自溶。黄曲霉自溶。d.青霉菌：在青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。很低下能够生长。提前放罐。发酵发酵后期污染后期污染染菌量不太多，可继续发酵。染菌量不太多，可继续发酵。污染严重，则提前放罐。污染严重，则提前放罐。杀菌剂的添加：杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本前期无必要，增加成本；发现后加入，效果要具体评价。发现后加入，效果要具体评价。（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的
7、影响）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响l 丝状菌发酵被产酸菌污染：丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难。量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难。处理方法：处理方法：将发酵液加热后再加助滤剂；将发酵液加热后再加助滤剂；先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀l 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化。溶媒之间极易发生乳化。二、杂菌二、杂菌污染的防治污染的防治1、染菌的检查与类型
8、判断、染菌的检查与类型判断(1)显微镜检查法：菌体显微镜检查法：菌体(2)平板划线培养或斜面培养检查法：菌落平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑(3)肉汤培养检查法肉汤培养检查法（酚红变色（酚红变色pH6.8-8.4）以上方法缺点：以上方法缺点：镜检出杂菌需要一定时间。镜检出杂菌需要一定时间。(4)发酵过程的异常现象判断发酵过程的异常现象判断uDO2水平异常变化：水平异常变化：upH异常变化：异常变化：污染产酸菌或者利用碳源效率高生长较快的杂菌污染产酸菌或者利用碳源效率高生长较快的杂菌u尾气尾气CO2异常变化：异常变化：染菌引
9、起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快，染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快，CO2含量增加；染噬菌体，糖耗减慢，含量增加；染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。含量减少。12污染噬菌体后异常现象污染噬菌体后异常现象2.污染原因分析污染原因分析 主要原因：主要原因：种子带菌种子带菌 无菌空气带菌无菌空气带菌 设备渗漏设备渗漏 灭菌不彻底灭菌不彻底 操作失误操作失误 技术管理不善技术管理不善(1)从杂菌种类看：从杂菌种类看：u耐热芽孢杆菌：与灭菌不彻底有关。耐热芽孢杆菌：与灭菌不彻底有关。u球菌、无芽孢杆菌：与种子带菌、球菌、无芽孢杆菌：与种子带菌、无菌空气带菌、无菌空气带菌、设备渗漏、操
10、作失误有关。设备渗漏、操作失误有关。u浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏u霉菌：与操作失误、霉菌：与操作失误、技术管理不善有关，即无菌技术管理不善有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题。室灭菌不彻底或操作问题。u酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长。酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长。(2)从污染时间看：从污染时间看：u早期污染可能与早期污染可能与 种子带菌、无菌空气带菌、灭菌种子带菌、无菌空气带菌、灭菌不彻底不彻底、操作失误、操作失误 有关。有关。u后期污染可能与设备渗漏、操作失误及中间补料后期污染可能与设备渗漏、操作失误及中间补料有关。有关。
11、(3)从染菌幅度看：从染菌幅度看：u各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题。一种杂菌，一般是空气系统问题。u个别罐连续染菌，一般是设备问题。个别罐连续染菌，一般是设备问题。3、杂菌污染的途径及其预防、杂菌污染的途径及其预防(1)种子带菌的防治种子带菌的防治 u灭菌彻底：培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压。灭菌彻底：培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压。u接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠。接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠。u保藏可靠：保藏可靠：(2)过滤空气带菌的防治过滤空气带菌的防治u提高空气进口的洁净度。
12、提高空气进口的洁净度。u除尽压缩空气中的油和水。除尽压缩空气中的油和水。u保证空气过滤器介质的填装质量。保证空气过滤器介质的填装质量。(3)设备的渗漏或设备的渗漏或“死角死角”造成的染菌及其防治造成的染菌及其防治u发酵罐的发酵罐的“死角死角”法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件。撑件。口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口。料管口。发酵罐罐底发酵罐罐底脓疱状积垢脓疱状积垢造
13、成造成“死角死角”消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀放汽边阀 管道安装不当或配置不合理管道安装不当或配置不合理形成的形成的“死角死角”污水脓疱罐底 发酵罐罐底脓疱状积垢造成发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角死角”法兰连接不当造成的法兰连接不当造成的“死角死角”灭菌时蒸汽不易通达的灭菌时蒸汽不易通达的“死角死角”及其消除方及其消除方法法u设备渗漏引起的染菌及其防止设备渗漏引起的染菌及其防止发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、摩发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，造成渗漏。擦和振动等原因，造成渗漏。方法：选用优质的材料，并定期
14、进行检查。方法：选用优质的材料，并定期进行检查。微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞 指指示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色。示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色。(4)培养基与设备灭菌不彻底的防治培养基与设备灭菌不彻底的防治u原料性状：大颗粒的原料过筛除去。原料性状：大颗粒的原料过筛除去。u假压：实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。假压：实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。u灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂，防止泡灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂，防止泡沫升顶。沫升顶。u连消不彻底连消不彻底：蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，：蒸汽压力波动大，培
15、养基未达到灭菌温度，最好采用自动控制装置最好采用自动控制装置。u灭菌后期罐压骤变：灭菌后，冷却水冷却时，如冷却过灭菌后期罐压骤变：灭菌后，冷却水冷却时，如冷却过快造成罐内负压造成染菌。冷却前先通入无菌空气维持快造成罐内负压造成染菌。冷却前先通入无菌空气维持罐内一定的正压，再进行冷却罐内一定的正压，再进行冷却。u死角死角：消除。：消除。(5)操作不当造成染菌操作不当造成染菌u移种时或发酵过程中，罐内压力跌至零。移种时或发酵过程中，罐内压力跌至零。u管道阀门操作不当，无菌空气的压力突然下降，罐内压力管道阀门操作不当，无菌空气的压力突然下降，罐内压力高，发酵液倒流进入与发酵罐液面下相连的各个管道以及
16、高，发酵液倒流进入与发酵罐液面下相连的各个管道以及空气过滤器空气过滤器。(6)噬菌体染菌及其防治噬菌体染菌及其防治u以净化环境为中心的综合防治法。以净化环境为中心的综合防治法。采取哪些措施能够保持无菌发酵？采取哪些措施能够保持无菌发酵？物料、培养基、中间补料要灭菌；物料、培养基、中间补料要灭菌；发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；好气发酵通入的空气要除菌；好气发酵通入的空气要除菌；种子无污染；接种无菌操作过关；种子无污染；接种无菌操作过关；为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。为了
17、保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。第二节第二节 发酵培养基及设备管道灭菌发酵培养基及设备管道灭菌1.1.化学试剂灭菌法化学试剂灭菌法 甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒2.2.射线灭菌法射线灭菌法3.3.干热灭菌法干热灭菌法 电磁波、紫外线或放射性物质电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱适用范围：无菌室、接种箱常用烘箱，灭菌条件：常用烘箱，灭菌条件：160160下保温下保温1h 1h 适用范围：金属或玻璃器皿适用范围：金属或玻璃器皿4.4.湿热灭菌法湿热灭菌法 利用饱和蒸汽灭
18、菌，条件：利用饱和蒸汽灭菌，条件：121121，30min 30min 适用范围：生产设备及适用范围：生产设备及培养基灭菌培养基灭菌5.5.过滤除菌法过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气适用范围：制备无菌空气 6.6.火焰灭菌法火焰灭菌法 火焰火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口 一、常用的灭菌方法一、常用的灭菌方法 湿热灭菌的优点：湿热灭菌的优点：蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热（冷凝热）；蒸
19、汽有很大的潜热（冷凝热）；操作方便，易管理。操作方便，易管理。培养基的湿热灭菌培养基的湿热灭菌 热阻热阻 定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死比死亡速率常数亡速率常数k来表示来表示。k，热阻，热阻,tkNdtdNktNNt0ln 当温度当温度T一定时，一定时，k随微生物不同而不同，具体随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。值为标准。当当 T 变化时，变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律尼乌斯定律 k=Aexp(-E/RT)k与微生物活化能及与微生物活化能及T有关有关 热阻热
20、阻 大肠杆菌在不同温度下大肠杆菌在不同温度下的残留曲线的残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线温度下的死亡曲线 影响培养基灭菌的其它因素影响培养基灭菌的其它因素 u培养基成分培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性物等增加微生物的耐热性 低浓度（低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。以上，则减弱微生物的耐热性。upH：pH6.0-8.0，微生物
21、最耐热，微生物最耐热，pH20 m)，且雾粒浓度较大，故适宜用，且雾粒浓度较大，故适宜用旋风分离器旋风分离器分离。分离。l第二冷却器使空气进一步冷却后析出较小雾粒第二冷却器使空气进一步冷却后析出较小雾粒(1 m)，宜采，宜采用用丝网分离器丝网分离器分离，这样发挥丝网能够分离较小直径的雾粒和分离，这样发挥丝网能够分离较小直径的雾粒和分离效率高的作用。分离效率高的作用。l通常，第一级冷却到通常，第一级冷却到3035，第二级冷却到，第二级冷却到2025。l除水后，空气的相对湿度仍是除水后，空气的相对湿度仍是100，须用丝网分离器后的，须用丝网分离器后的加热器将空气中的相对湿度降低至加热器将空气中的相
22、对湿度降低至5060，以保证过滤器，以保证过滤器的正常运行。的正常运行。l尤其适用于潮湿地区，其他地区可根据当地的情况，对流程尤其适用于潮湿地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。中的设备作适当的增减。2.冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程 压缩空气从储罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，压缩空气从储罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理的高温压缩空气混合，此时混合空气已达到温度为的高温压缩空气混合，此时混合空气已达到温度为3035，相对湿
23、度为相对湿度为5060的要求，在进入过滤器过滤。的要求，在进入过滤器过滤。2.冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程特点：特点：l省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备，流省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备，流 程简单；程简单；l 利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少。利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少。适用于中等湿含量地区，但不适合空气湿含量高的地区。适用于中等湿含量地区，但不适合空气湿含量高的地区。采用高效率的前置过滤设备，利用压缩机的抽吸作用，使采用高效率的前置过滤设备，利用压缩机的抽吸作用，使空气先经中、高效过滤后，再进入空气压缩机，降低
24、了主过滤空气先经中、高效过滤后，再进入空气压缩机，降低了主过滤器的负荷，所得的空气无菌程度很高。器的负荷，所得的空气无菌程度很高。3.高效前置过滤空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程4.利用热空气加热冷空气的流程利用热空气加热冷空气的流程l利用压缩后的热空利用压缩后的热空气和冷却后的冷空气气和冷却后的冷空气进行热交换，使冷空进行热交换，使冷空气的温度升高，降低气的温度升高，降低相对湿度。相对湿度。l对热能的利用比较对热能的利用比较合理，热交换器可兼合理，热交换器可兼做贮气罐，但由于做贮气罐，但由于气气气换热的传热系气换热的传热系数很小，加热面积要数很小，加热面积要足够大才能满足要求。足够大才能
25、满足要求。提高过滤除菌效率的措施提高过滤除菌效率的措施 减少进口空气的含菌数量，主要方法：正确选择减少进口空气的含菌数量，主要方法：正确选择进风口；提高进口空气的采气位置；采用粗过滤进风口；提高进口空气的采气位置；采用粗过滤预处理。预处理。设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。的过滤介质。针对不同地区，设计合理的空气预处理工艺流程，针对不同地区，设计合理的空气预处理工艺流程，以达到除油、水和杂质的目的以达到除油、水和杂质的目的。降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作，主要方法：滤介质能在干燥状态下工作，主要方法：使用使用无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去除无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去除油、水；提高进入过滤器的空气温度。油、水；提高进入过滤器的空气温度。稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。提高过滤除菌效率的措施提高过滤除菌效率的措施
