1、高效液相色谱高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography，HPLC)第一部分第一部分原理与结构原理与结构一、色谱概述一、色谱概述二、二、高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)(HPLC)三、几种主要的三、几种主要的HPLCHPLC四、四、HPLCHPLC特点、流程及主要部件特点、流程及主要部件 1.什么是色谱什么是色谱?色谱是色谱法的简称色谱是色谱法的简称(又叫色层法又叫色层法,层析法层析法),),其其本质是本质是一种分离分析方法一种分离分析方法常见的分离方法常见的分离方法l蒸馏蒸馏l离心离心l电泳电泳l过滤过滤l色谱色谱(目前最有效的分离方法目前最
2、有效的分离方法)一、色谱概述一、色谱概述2.2.色谱法简介色谱法简介色谱法色谱法(Chromatography)溯源溯源 100多年前俄国植物学家多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素分离植物色素时采用的实验方法时采用的实验方法 他将植物色素的他将植物色素的石油醚提取液石油醚提取液倒入装有倒入装有碳酸碳酸钙钙的直立玻璃管的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带色的谱带 Tswett用希腊语用希腊语chroma(色色)和和graphos(谱谱)描描述他的实验方法，即现在的述他的实验方法
3、，即现在的Chromatography(色谱法色谱法)3.3.色谱法的发展色谱法的发展 色谱法是一种现代的分离方法色谱法是一种现代的分离方法 1906年正式命名年正式命名 20世纪世纪30年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪世纪70年代年代4.4.色谱法原理色谱法原理 色谱法的原理色谱法的原理 利用混合物中各组份在不同的两相利用混合物中各组份在不同的两相(流动相、固定相）流动相、固定相）中中溶解溶解,分配分配,吸附吸附等化学作用性能的差异等化学作用性能的差异,当流动相中当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发
4、生作用所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用力的作用)。由于混合物中各组分在由于混合物中各组分在性质和结构性质和结构上有差异，与固定相上有差异，与固定相发生发生作用的大小作用的大小也有差异。因此，在同一推动力作用下，也有差异。因此，在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。不同的次序从固定相中流出。两相中有一相是固定的两相中有一相是固定的,叫作叫作固定相固定相(Stationary(Stationary Phase),Phase),有一相是流动的有一相是流动的,称为称为流动相
5、流动相(Mobile Phase),(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂流动相又叫洗脱剂,溶剂溶剂n相相(Phase):物理化学术语物理化学术语,特指在某一系统中特指在某一系统中,具有相同成具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各。各相之间有明显可分的界面。相之间有明显可分的界面。n 分离分离 分离分离是一个物理过程。是一个物理过程。固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进样进样(Injection)洗脱洗脱(Elution)相互作用相互作用(Interaction)Temporal co
6、urse淋洗液淋洗液5.5.色谱法的分类色谱法的分类(1)(1)按分离过程的机理分按分离过程的机理分:l吸附色谱吸附色谱(Absorption Chromatography)(Absorption Chromatography)l根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离不同实现分离l分配色谱分配色谱(Partition Chromatography)(Partition Chromatography)l分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度度(分配系数分配系数)不同不同l离子交换色谱离子交换色谱(I
7、on Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography)l根据样品组份离子交换亲和力的差异分离根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简简称离子色谱称离子色谱(IC)(IC)l GPC(Gel Permeation Chromatography)固定相是疏水性凝胶固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂流动相是有机溶剂l GFC(Gel Filtration Chromatography)固定相是亲水性凝胶固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液流动相是水溶液利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离
8、的方法分离的方法l 体积排除色谱体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)l 亲和色谱亲和色谱 l利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。性亲和力，进行选择性分离。(2)按流动相的物态分按流动相的物态分:l气相色谱气相色谱(Gas Chromatography,GC)用气体作为流动相用气体作为流动相(又叫载气又叫载气)l液相色谱液相色谱(Liquid Chromatography,LC)用液体作为流动相用液体作为流动相(又叫洗脱剂又叫洗脱剂)(3)按固定相的形态分按固定相的形态分:l平面色谱平面色
9、谱l纸色谱纸色谱l薄层色谱薄层色谱l柱色谱柱色谱色谱法分类示意图色谱法分类示意图色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高高效效液液相相色色谱谱H HP PL LC C气相色谱二、高效液相色谱二、高效液相色谱(HPLC)l HPLC 的产生的产生l HPLC 的固定相的固定相l HPLC 的流动相的流动相1.HPLC的产生的产生l液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用柱在室温和常压下用液位差液位差输送流动相，输送流动相，称为经典液相色谱法称为经典液相色谱法l柱效低、时间长柱效低、时间长(常有几个小时常有几个小时)。l高效高效液相色谱法液相色谱法(Hi
10、gh performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上的基础上,于于60年代后期引入了气相色谱理论而年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。迅速发展起来的。l与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力但会引起高阻力,需用高压输需用高压输送流动相送流动相,故又称故又称高压高压液相色谱法液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC).l因分析速度快而又称为因分析速度快而又称为高速高速液相
11、色谱法液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称。也称现代液相色谱。现代液相色谱。lHPLC 是一种区别于经典液相色谱是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方基于仪器方法的高效能分离手段法的高效能分离手段 高性能色谱柱高性能色谱柱,高精度输液泵高精度输液泵,高灵敏度检测高灵敏度检测器器 广泛应用于各个领域广泛应用于各个领域:医药医药,环保环保,石化石化,生命生命科学科学,食品工业食品工业,农业农业 无论在技术上无论在技术上,理论上理论上,还是在应用上仍有较还是在应用上仍有较大的发展空间大的发展空间2.2.高效液相色谱的固定相高效液相色谱的固定相(
12、1)固定相以承受高压能力来分类，可分为固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体刚性固体 和硬胶和硬胶两大类。两大类。l刚性固体刚性固体 以二氧化硅为基质，可承受以二氧化硅为基质，可承受7.0 1081.0 109 Pa 的高压，可制成直径、形状、孔隙度的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。的一种固定相。l硬胶硬胶 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压由
13、聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为力上限为3.5 108 Pa。l表面多孔型固定相表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。(2)固定相按孔隙深度分类，可分为固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全表面多孔型和全多孔型多孔型两类。两类。多孔层厚度小多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效高；效高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速颗粒较大，渗透性好，装
14、柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。l全多孔型固定相全多孔型固定相 由直径为由直径为10nm的硅胶微粒凝聚的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒细而成。这类固定相由于颗粒细(510 m)，孔仍，孔仍然较浅，传递速率快，易实现高效、高速。特别然较浅，传递速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及衡量分析。适合复杂混合物分离及衡量分析。3.3.液相色谱的流动相液相色谱的流动相 (1)1)流动相特性流动相特性l液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。液相色谱的流动相又称为：
15、淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况分离状况.l亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。法，极性柱也称正相柱。l若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。两种类型分离柱上的出峰顺序相反。(2)流动相类别流动相类别l 按流动相组成分：单组分和
16、多组分；按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。l常用溶剂：常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、酯、乙醇、乙腈、乙醇、乙腈、水。水。l采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。或调整出峰时间。(3)流动相选择流动相选择l在选择溶剂时，在选择溶剂时，溶剂的极性溶剂的极性是选择的重要依据。是选择的重要依
17、据。l溶剂的极性越高，则保留时间缩短，通过改变流溶剂的极性越高，则保留时间缩短，通过改变流动相的极性可以得到理想的保动相的极性可以得到理想的保留时间。留时间。l常用溶剂的极性顺序：水常用溶剂的极性顺序：水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙乙腈腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢四氢呋喃呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙异丙醚醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)。(4)(4)流动相的要求流动相的要求l流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对
18、组分流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：对流动相溶剂的要求是：l溶剂对于待测样品，须具有合适的极性和良好的选择性。溶剂对于待测样品，须具有合适的极性和良好的选择性。l溶剂与检测器匹配溶剂与检测器匹配 对于对于紫外吸收检测器紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。的紫外截止波长要长。(所谓溶剂的紫外截止波长指当小所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸于截止波长的辐射通过溶剂
19、时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量吸收测量)。对于对于折光率检测器折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。l高纯度高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。l化学稳定性好化学稳定性好l低粘度低粘度(粘度适中粘度适中)若使用高粘度溶剂，势必增高压
20、力，若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离不利于分离 常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。(5)(5)选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题l尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。坏色谱柱和使检测器噪声增加。l避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。避免
21、流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。l试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。中沉积。l流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。流动相不应有紫外吸收。按分离机制的不同分为：按分离机制的不同分为：l 吸附色谱法吸附色谱法l 分配色谱法分配色谱法l 交换色谱法（交换色谱法（离子离子）l 体积排阻色谱法体积排阻色谱法l 亲和色谱法亲和色谱法三、
22、几种主要的三、几种主要的HPLC(一一)吸附吸附(液液-固固)色谱色谱l基本原理：基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。l固定相：固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的是是5 510m10m的硅胶吸附剂。的硅胶吸附剂。l流动相：流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。l应用：应用：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。l缺点：缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖
23、尾。非线形等温吸附常引起峰的拖尾。l基本原理：基本原理：利用试样各组分在固定相和流动相上的分配比利用试样各组分在固定相和流动相上的分配比例不同而分离。在固定相上分配多的组分（分配系数高）例不同而分离。在固定相上分配多的组分（分配系数高）后出峰，分配少（分配系数低）的先出峰。后出峰，分配少（分配系数低）的先出峰。l流动相：流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相相的极性小于固定液的极性（正相 normal phasenormal phase），反），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相之，流动相的极性大于固定液
24、的极性（反相 reverse reverse phasephase）。正相与反相的出峰顺序相反；）。正相与反相的出峰顺序相反；l固定相：固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；l化学键合固定相：化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。胶（担体）表面的游离羟基上。C-18C-18柱（反相柱）。柱（反相柱）。(二二)分配（液分配（液-液）色谱液）色谱(三三)离子交换色谱离子交换色谱l基本原理：基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应；组分组分在固定相上发生反复离子交换反应；组分与
25、离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在 形式等有关。亲和力大，保留时间长。形式等有关。亲和力大，保留时间长。阳离子交换：阳离子交换：R-SOR-SO3 3H +MH +M+=R-SO =R-SO3 3 M+H M+H+阴离子交换：阴离子交换：R-NRR-NR4 4OH+XOH+X-=R-NR=R-NR4 4 X+OHX+OH-l 固定相：固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂。阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂。l流动相：流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子
26、离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液。阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液。l应用：应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等阳阳离子交换分离机理离子交换分离机理 Temporal course 阴离子交换阴离子交换分离机理分离机理m(四四)体积排阻色谱体积排阻色谱l固定相：固定相：具有一定大小孔隙具有一定大小孔隙的的凝胶凝胶；l原理：原理：借助多孔性凝胶孔径借助多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，而首先的空隙通过
27、色谱柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小分别先后按分子的相对大小分别先后流出。流出。(五五)亲和色谱亲和色谱 l原理：原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。亲和力，进行选择性分离。l先在载体表面键合上一种先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的间隔具有一般反应性能的间隔臂臂(环氧、联胺等环氧、联胺等)，再连，再连接上配基接上配基(酶、抗原等酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留生物大分子作用而被保
28、留.改变淋洗液后洗脱。改变淋洗液后洗脱。按分离过程物理化学原理分类的各种按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较液相色谱法的比较具有锁匙结具有锁匙结构络合物的构络合物的可逆性离解可逆性离解 多孔凝胶的渗多孔凝胶的渗透或过滤透或过滤 可逆性的可逆性的离子交换离子交换 吸附与解吸吸附与解吸 分离原分离原理理 不同不同pH值值的缓冲溶液，的缓冲溶液，加入改性剂加入改性剂 有机溶剂或一有机溶剂或一定定pH值的缓值的缓冲溶液冲溶液 不同不同pH值的缓冲值的缓冲溶液溶液 不同极性有不同极性有机溶剂机溶剂 流动相流动相 多种不同性多种不同性能的配位体能的配位体键联在固相键联在固相基体上基体上 具有不
29、同孔径具有不同孔径的多孔性凝胶的多孔性凝胶 高效微粒高效微粒离子交换离子交换剂剂 溶解与挥发溶解与挥发 不同极性有不同极性有机溶剂和水机溶剂和水 固定液载在固定液载在固相基体上固相基体上 全多孔固体全多孔固体吸附剂吸附剂 固定相固定相 亲和色谱亲和色谱体积排阻色谱体积排阻色谱离子色谱离子色谱分配色谱分配色谱吸附色谱吸附色谱相相色谱色谱四、四、HPLC特点、流程及特点、流程及主要部件主要部件 l特点特点l流程流程l主要部件主要部件HPLC仪器（仪器（1）液相色谱仪（液相色谱仪（2）液相色谱仪（液相色谱仪（3）液相色谱仪（液相色谱仪（4）1.HPLC的特点的特点l 分离效能高分离效能高l 选择性能
30、高选择性能高l 检测灵敏度高检测灵敏度高l 分析速度快分析速度快2.2.流程流程淋洗液淋洗液 高压高压泵泵分离分离柱柱检测器检测器 泵液泵液分离分离 检测检测 记录记录进样进样器器抑制器检测检测器器进样进样3.3.主要部件主要部件l 输液泵输液泵(高压高压)l 梯度淋洗器梯度淋洗器(装置装置)l 进样器进样器(装置装置)l 分离器分离器(柱柱)l 检测器检测器(装置装置)l 结果记录器结果记录器(计算机及软件计算机及软件)(1)(1)高压输液泵高压输液泵l主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。l为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定
31、相（10m），液），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。高速是高效液相色谱的特点之一。l应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(2)(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置l外梯度外梯度(低压梯度低压梯度):一台高压泵一台高压泵,通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。l梯度梯度:不同溶剂的比例不同溶剂的比例.通过设置不同溶剂之间的比例通过设置不同
32、溶剂之间的比例(梯梯度度)使流动相的强度、极性、使流动相的强度、极性、pHpH值或离子强度相应地变化，值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。l内梯度内梯度(高压梯度高压梯度):):两台两台高压输液泵，将两种不同高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。进入色谱柱。(3)(3)进样装置进样装置(器器)l流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置通阀进样装置.有手动与自动进样两种有手动与自动进样两种。(4
33、)(4)检测器检测器(装置装置)特点：特点：应用广，对大部分有机化合物有响应应用广，对大部分有机化合物有响应;灵敏度高灵敏度高(10-9g)；线形范围高；线形范围高；A.紫外检测器紫外检测器(Ultraviolet Detector,UVD)原理：原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率透光率的变化的变化来测定样品浓度来测定样品浓度.对流动相的流速和温度对流动相的流速和温度变化不敏感；变化不敏感；波长可选，易于操作；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。常用紫外吸收检测器常用紫外吸收检测器 l固定波长紫外吸收检测器固定波长紫外吸收检
34、测器 l可变波长紫外吸收检测器可变波长紫外吸收检测器 l光二极管阵列检测器光二极管阵列检测器B.示差折光指数检测器示差折光指数检测器原理原理:监测参比池和测量池中溶液的监测参比池和测量池中溶液的折射率折射率之差来测量之差来测量试样浓度试样浓度,差值与浓度呈正比差值与浓度呈正比.通用型检测器（每种通用型检测器（每种物质具有不同的折光物质具有不同的折光指数指数(率率)）；）；灵敏度低灵敏度低(10(10-6-6g)g)、对、对温度敏感、不能用于温度敏感、不能用于梯度洗脱；梯度洗脱；偏转式、反射式和干偏转式、反射式和干涉型三种；涉型三种；示差折光指数检测器示差折光指数检测器C.荧光检测器荧光检测器(
35、Fluorescence Detector,FLD)原理：原理：利用利用某些溶质在紫某些溶质在紫外光激发后能发射可见光外光激发后能发射可见光（荧光）（荧光）的性质检测。的性质检测。激发光激发光(波长波长),),发射光发射光(波波长长););高灵敏度（高灵敏度（1010-12-12g g）、高选）、高选择性；择性；对流量和温度敏感性低。对流量和温度敏感性低。原理：监测溶液的原理：监测溶液的电导率变化电导率变化的检测器。的检测器。特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度高动相的组成变化有明显响应、灵敏度高(10(10-12-1
36、2 g g）。适用于离子型化合物）。适用于离子型化合物,如单胺类神经递质如单胺类神经递质.D.电化学检测器电化学检测器(Electrical chemistry detector or Electron Capture Detector,ECD)电导仪电导仪电极电极电极电极(5)(5)分离柱分离柱(装置装置)柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm;可以通过改变填料粒度和柱径以提高柱效。可以通过改变填料粒度和柱径以提高柱效。柱是柱是 HPLC 的心脏，用不同的柱，因其分离机理也不的心脏，用不同的柱，因其分离机理也不同，得到的效果也不同。同，得到的效果也不同。常用：反相常用：反相 HPLC柱，疏水柱，疏水 HPLC柱，凝胶过滤柱，凝胶过滤 HPLC柱，各种离子交换柱，各种离子交换 HPLC 柱，亲和柱，亲和 HPLC 柱等等柱等等五、五、HPLC的结果分析与处理的结果分析与处理第二讲第二讲
