1、.1基本实验技术基本实验技术.2内容提要内容提要 一、基本实验技术和方法一、基本实验技术和方法 细胞培养细胞培养 MTT 划痕修复划痕修复 western blot siRNA 二、如何把实验做好（心得体会）二、如何把实验做好（心得体会）.3一、基本实验技术和方法一、基本实验技术和方法（一）细胞培养（一）细胞培养 1 培养细胞的特性培养细胞的特性 培养细胞的生长方式培养细胞的生长方式 贴附生长：贴附生长：贴附于支持物表面贴附于支持物表面 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长悬浮生长：于悬浮状态下即可生长.4游离期 贴壁期.5.6潜伏期潜伏期 对数生长期对数生长期 停止期（平台期）停止期（平台期）.7
2、培养细胞生长的条件培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要（血清质量好坏是实验成败的细胞的营养需要（血清质量好坏是实验成败的关键）关键）2 细胞的生存环境细胞的生存环境 温度温度:37 O2 20%CO2:5%CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-pH:7.2-7.4 渗透压渗透压 3 无污染无污染 4 无毒无毒.82.四唑盐（四唑盐（MTT）比色法）比色法 原理：原理：（1）活细胞）活细胞 线粒体线粒体 脱氢酶脱氢酶（2）可溶性的四）可溶性的四唑唑盐还原成不溶于水的蓝盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（紫色产物（formazan)，沉淀在细胞中，而，沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。死细胞没有
3、这种功能。.9预实验预实验 OD:0.81.2 有效值有效值（线性范围）（线性范围）吸光度与所含的吸光度与所含的formazan量成正比量成正比细胞点板量的确定（保证所测的细胞点板量的确定（保证所测的con值在值在0.8-1.2 之间）之间）不同的细胞株不同不同的细胞株不同不同的时间点不同不同的时间点不同.10每孔细胞量24 h24 h48 h48 h300030000.40.40.50.5500050000.60.60.70.7800080000.80.80.90.910000100001 11 112000120001.11.11.11.115000150001.21.21.21.2200
4、00200001.31.31.41.4.11细胞计数细胞计数104 个/ml每孔点板 100 l 给药 100 l.12 操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；8000个细胞/孔，每孔培养基总量200微升（100+100），37、5 CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克毫升的MTT液（20微升孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（100微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570 nM）。记录结果，绘制.13点板注意事项点板注意事项 蛇行点板 十字交叉给药方向给药方向点
5、板方向点板方向.14 直接比较各组直接比较各组OD值值 计算抑制率，公式计算抑制率，公式（对照（对照-本底）本底）-（给药（给药-本底）本底）/（对照（对照-本底）本底）*100%.153.划痕修复实验（划痕修复实验（wound healing）原理：肿瘤细胞运动特性之一：侧向迁移能力原理：肿瘤细胞运动特性之一：侧向迁移能力 借鉴体外细胞至伤愈合模型，在体外培养的单层借鉴体外细胞至伤愈合模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后观察处理后细胞迁移的能力细胞上，划痕致伤，然后观察处理后细胞迁移的能力0 h24 hCon(10%血清)给药.16实验步骤实验步骤 1.细胞点板，具体数量因细胞不同而
6、不同，并根据给药时间和条件来定。2.第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜。3.用PBS洗细胞3次，去除划落的细胞，加入培养基。4.放入37 5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样，拍照。.17实验要点实验要点 划痕质量划痕质量 宽度宽度 笔直程度笔直程度划痕后一定要清洗干净划痕后一定要清洗干净.18结果处理结果处理Part 1Part 2.194.Western blot 原理：原理：经过电泳经过电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体分离的蛋白质样品，转移到固相载体 抗原抗体反应抗原抗体反应 先分离后分析先分离后分析蛋白含量或者表达、存在形式的变化蛋白
7、含量或者表达、存在形式的变化.20 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色实验步骤实验步骤.21实验要点实验要点 1.上样量 蛋白KD数 2.制胶：上层胶和下层胶的比例 上层胶不能有碎胶 泳道笔直 3.加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象 4.转膜：成功的关键 保证时间 不同厚度的胶最好不要一起转.22 5.合适一抗浓度 低：没有条带或条带不清晰高：非特异性结合 杂带 6.样品缓冲液中煮沸的样品可在-20存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解.235.siRNA 原理原理 dsRNA的剪切的剪切 RISC的形成的形成
8、siRNA介导的介导的RISC 对对mRNA的剪切作用的剪切作用.24RISC（RNA-induced silencing complex）.25 选择、设计、合成选择、设计、合成siRNA双链（双链（5种）种）化学合成化学合成siRNA质粒表达质粒表达siRNA 转染转染siRNA到靶细胞到靶细胞瞬时表达瞬时表达 化学合成化学合成siRNA，质粒表达质粒表达siRNA稳定表达稳定表达 质粒表达质粒表达siRNA 分析检测分析检测RNA干扰作用干扰作用蛋白水平蛋白水平:WB/IF/FCmRNA水平水平:RT-PCR、northern blotting siRNA基因沉默实验设计基因沉默实验设计
9、.26siRNA转染方法转染方法 磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀 DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene 电穿孔法电穿孔法 机械法机械法 阳离子脂质体试剂阳离子脂质体试剂 阳离子聚合物阳离子聚合物 病毒介导法病毒介导法.27DNA or siRNA:highly anionic and hydrophilic macromoleculeNo ionic interaction+Cationic macromolecule+Cationic ReagentMembrane:anionic and hydrophobic-.28siRNA转染试剂转染试剂 Lipofectamine 2000（In
10、vitrogen）INTERFERin（Polyplus）Oligofectamine（Invitrogen）HiPerFect（Qiagen）SiLentFect（BioRad）.29转染的检测转染的检测 .30步骤步骤.31.32.33.34注意事项注意事项 避免避免RNA酶污染酶污染 细胞状态细胞状态 培养基和严格的操作确保转染的重复性培养基和严格的操作确保转染的重复性 避免使用抗生素避免使用抗生素 根据转染试剂对细胞的毒性调整转染时间根据转染试剂对细胞的毒性调整转染时间.35二、如何把实验做好（心得体会）二、如何把实验做好（心得体会）（一）准备工作（一）准备工作 熟悉实验方法（熟记于心）提前一天准备实验用品（细胞、试剂、耗材、实验仪器）（二）规范的操作（二）规范的操作（三）不要想当然的解决问题（三）不要想当然的解决问题（四）及时沟通分析失败的原因（四）及时沟通分析失败的原因（五）准时处理结果（五）准时处理结果个人观点供参考，欢迎讨论！
