1、分子生物学大实验习题及解答一、名词解释1、genome；2、基因芯片；3、持家基因；4、Operon；5、感受态细胞；6、逆转录酶；7、PCR技术；8、转化；9、重组DNA技术 ；10、基因沉默；11、hnRNA；12、复制子；13、反义RNA；14、衰减子；15、拟基因；16、RNA编辑；17、颠换；18、拓扑异构酶；19、变性；20、转座子二、基础理论单项选择题1、DNA连接酶的作用为（ ）A、合成RNA引物 B、将双螺旋解链 C、去除引物、填补空隙 D、使双螺旋DNA链缺口的两个末端连接 2、DNA复制中RNA引物的主要作用是( )。 A、引导合成冈奇片段 B、作为合成冈奇片段的模板 C
2、、为DNA合成原料dNTP提供附着点 D、激活DNA聚合酶 3、下列哪一种蛋白不是组蛋白的成分（ ） A、 H1 B、H2A 、H2B C、 H3、H4 D、 H5 4、DNA的变性：（ ） A、包括双螺旋的解旋 B、可以由低温产生 C、是可逆的 D、是磷酸二酯键的断裂 5、转录需要的原料是:（ ）A、 dNTP B、 dNDP C、 dNMP D、 NTP 6、在原核生物复制子中以下哪种酶除去RNA引发体并加入脱氧核糖核甘酸： A、DNA聚合酶 B、 DNA聚合酶 C、DNA聚合酶 D、外切核酸酶MFl 7、下真核生物复制起始点的特征包括（ ）A、富含GC区 B、富含AT区 C、 Z DNA
3、 D、无明显特征8、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（ ） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同9、DNA复制时不需要以下哪种酶？（ ）A、 DNA指导的DNA聚合酶 B、RNA指导的DNA聚合酶C、拓扑异构酶D、连接酶10、1、证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是：肺炎链球菌在老鼠体内的毒性和T2噬菌体感染大肠杆菌。这两个实验中主要的论点证据是：（ ） A、从被感染的生物体内重新分离得到DNA，作为疾病的致病剂 B、DNA突变导致毒性丧失 C、生物体吸收的外源DNA（而并非蛋白质）改变了其遗传潜能 D、DNA是不能
4、在生物体间转移的，因此它一定是一种非常保守的分子11、利用自己的位点专一重组酶把自己从寄主基因组中的一个地方移到另一个地方的遗传元件叫（ ）A、启动子 B、转座子 C、T-DNA D、顺反子12、原核DNA合成酶中（ ）的主要功能是合成前导链和冈崎片段A、DNA聚合酶 B、DNA聚合酶 C、DNA聚合酶 D、引物酶 13、在基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒以便于重组和筛选。已知有些不同的限制酶也可能会切出相同的黏性末端限制酶I的识别序列和切点是一G GATCC一，限制酶的识别序列和切点是一GATC一。根据图示判断下列操作正确的是（ ）A、质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶切割
5、 B质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶I切割 C目的基因和质粒均用限制酶I切割 D目的基因和质粒均用限制酶切割14、下列描述最能确切表达质粒DNA作为克隆载体特性的是：A、小型环状双链DNA分子B、携带有某些抗性基因 C、在细胞分裂时恒定地传给子代细胞 D、具有自我复制功能15、基因工程中实现目的基因与载体DNA拼接的酶是： A、DNA聚合酶 B、RNA聚合酶 C、DNA连结酶 D、RNA连结酶 三、填空1、DNA聚合酶I有（ ）和（ ） 活性。 2、在真核生物中存在3种RNA聚合酶，RNA聚合酶I负责（ ）的合成、RNA聚合酶II负责 的合成（ ）RNA聚合酶III负责（ ）的合成。3、细菌
6、RNA聚合酶的核心酶由（ ）组成的，全酶还包括（ ）。4、DNA复制时，RNA引物的合成由（ ）负责，而引物的切除则由（ ）负责。5、真核细胞的染色体由（ ）、（ ）和（ ）组成。6、DNA复制时需要（ ）将DNA双链解开，靠（ ）维持单链结构。7、核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的（ ）和由大约200bp DNA组成的。八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而（ ）则在核小体的外面。 8、硝酸纤维素膜可结合（ ）链核酸。将RNA变性后转移到硝酸纤维素膜上再进行杂交，称（ ）印迹法。9、PCR又称（ ）包括三个步骤（ ）（ ）（ ）。四、问答1、质粒提取过程中，应注意哪些操作，为
7、什么?2、阐述RT-PCR的基本原理和和过程。3、在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物，分析可能的原因及解决办法。4、小量制备质粒DNA时发现质粒DNA不能被限制酶所切割，分析可能原因及解决办法。5、试阐述为了提高大肠杆菌感受态细胞转化效率, 实验中需考虑的几个重要因素。6、在RNA提取过程中应该注意事项？7、如何计算感受态的转化效率。参考答案一、名词解释1、生物体所含有的全部的遗传信息。2、核酸分子变性过程中，紫外吸收达到最大增量一半时的溶解温度。3、在生物体几乎所有的发育过程及所有的细胞中都能表达的基因。4、反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。是酶的特征物理学常数之一。近似
8、表示酶与底物的亲和力。5、用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。6、是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：6 i& H$ B- ) S( b# y% v) J1）依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链2) Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA；7 K W6 L & O0 + B3）依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链
9、cDNA。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。7、体外人工模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。8、是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。9、将目的DNA片段在体外进行改造、重组，然后转入受体细胞表达，从而改变生物性状的技术。10、是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其他RNA互补的RNA分子。11、是指最初的转录产物。包含有内含子序列。12、从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子13、14、
10、一种转录终止顺序，在这顺序处会发生弱化作用，即通过调节转录的终止来抑制细菌中的一些操纵子的表达。15、是一种畸变基因，即核甘酸序列同有功能的正常基因很很大的同源性，但由于突变，缺失或插入而不能表达，所以没有功能。16、是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象17、是指在突变过程中嘌呤变成嘧啶，或嘧啶突变为嘌呤的现象。18、拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。例：大肠杆菌中的DNA旋转酶19、DNA双
11、链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程称为变性。20、存在与染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。二、基础理论单项选择题1、D；2、A；3、D；4、A；5、A；6、C；7、B；8、B；9、B；10、A；11、B；12、C；13、A；14、D；15、C三、填空1、5-3聚合酶活性和5-3外切酶活性以及3-5外切酶活性2、rRNA、mRNA、tRNA3、；因子4、引物酶、氢键5、核小体、DNA、H16、解螺旋酶和拓扑异构酶、SSB7、核小体、H18、单、Northern9、寡聚酶链式反应、变性、退火、延伸四、问答1、答 ：从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和
12、裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和TritonX-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重
13、新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。 2、答 ：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。3、答： 1） RNA被降解：在用来验证完整性之前先在变性胶上分
14、析RNA；使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理；在100甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT；4 x$ z+ Z% P+ U, G) 2） RNA中包含逆转录抑制剂：过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25g到0.4g/l）以帮助小量样品RNA的恢复；逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐；将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产
15、量以检验抑制剂；6 / M; Mn( m4 I 3) 多糖同RNA共沉淀：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖；3 - , f* X5 v- K5 M 4） 用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火：确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25保温10分钟；对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列 ( l; d7 _ 2 y6 y5) 起始RNA量不够：增加RNA量；对于50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1g到0.5g乙酰BSA；9 w9 Y7 1 y B+ % d5 y- !
16、w R 6） RNA模板二级结构太多：将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火；提高逆转录反应温度，对SuperScript可以到50，对ThermoScript可以到65。注意：不要在60时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP；对于1kb的RT-PCR产物，保持反应温度65。注意：不要在高于37时使用M-MLV；如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物； 8 Z$ q2 a/ d; z! Z; L. t8 m7） 引物或模板对残余的RNA模板敏感：在PCR前用RNaseH处理。& L+ h# Y- x6 h/ y$ x8） 靶序列在分析的组织中不表达
17、：尝试其他靶序列或组织。PCR引物设计较差：避免在引物3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。最佳引物浓度介于0.1M到0.5M之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。9% F9 A9 ( E% K: M% U0 y0 P999999999）富含GC的模板：于GC含量50的模板，使用PCRx Enhancer Solution。10） 镁离子浓度太低：从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。 ( R) M9 q0
18、 . W- u) F4 S3 E& - F11） 退火温度太高：使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。4、答：由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去除干净导致。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质，如果总是依然存在，可用离心柱纯化DNA。5、答：1） 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD60
19、0 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2） 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3）试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4） 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均
20、应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 6、答：1）在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。9 _7 s) P9 Dv# o! s, b7 $ A2）有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高
21、到5060，并将反应时间缩短到1525min，但酶用量必须提高1020倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。1 gH# h0 A9 Q- N3）许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的锟类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。) h 3 F. m1 + Z7 F, d6 h$ 4）许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。7; D x. b n5 mi/ w% t/ 3 R7777777777777、答： 计算公式：转化效率产生菌落的总数/铺板DNA的总量（g ）。转化效率1106 cfu/g DNA可满足普通的亚克隆实验；1107 cfu/g DNA用于作更复杂的亚克隆,有限量的DNA的转化,T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为1108 cfu/g DNA。
