1、第十四讲第十四讲 水产动物的血清学检测水产动物的血清学检测技术技术免疫学综合实验 鱼类血清中凝集抗体效价的测定 鱼类白细胞吞噬活性的测定 鱼类血清中沉降效价的测定 鱼类血清中溶菌酶物质活性的测定血清学反应：在体外进行的抗原抗体反应基础：抗原抗体特异性结合反应原理：利用已知的抗原或抗体与未知的抗体或抗原进行结合反应，其反应的现象能用肉眼直接观察到或借助其仪器设备检测到，人们根据反应结果就能准确判断未知的抗原或抗体的性质、含量乃至位置特点：反应过程较短，能很快获得结果，该技术广泛应用于动物疾病诊断以及很多具抗原性的未知物的定性、定量和定位免疫血清学反应的一般特点免疫血清学反应的一般特点l特异性与交
2、叉性特异性与交叉性l抗原与抗体结合机制抗原与抗体结合机制 抗原和抗体结合为弱能量的非共价键结合，其结合力决定于抗原决定簇和抗体的抗原结合点之间形成的非共价键数量、性质和距离，由此可分为高亲和力、中亲和力和低亲和力抗体。抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这一过程受物理化学、热力学的法则所制约，结合的温度在040范围内，pH49。若温度超过60 或pH下降到3下时，抗原抗体复合物又可重新解离。利用这一特性，可进行免疫亲和层析，以制备免疫纯的抗原或抗体主要血清学检测技术及应用主要血清学检测技术及应用l凝聚性实验l中和实验l标记抗体技术凝聚性试验凝聚性试验l凝集试验 细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在
3、胶乳、离子交换柱和红细胞的抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块。参与凝集的抗体主要为IgG和IgM直接凝集实验直接凝集实验l颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集现象l玻片法为一种定性试验。将含有已知抗体的诊断血清（适当稀释）与待检菌悬液各一滴在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。可用于新分得细菌的鉴定和分型；也用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存在相应抗体l试管法为一种定量试验，用以检测待测血清中是否存在相应抗体和测定该抗体的含量，以协助临床诊断或供流行病学调查自家凝集：某些细菌在制成细菌悬液时很不稳定，在没有特异性抗体
4、存在的条件下，亦可发生凝集间接凝集试验间接凝集试验l将可容性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒（载体颗粒）的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝集反应反应沉淀试验沉淀试验l可溶性抗原（细菌的外毒素、内毒素）与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称l沉淀试验种类 环状沉淀试验 琼脂免疫扩散试验 免疫电泳技术环状沉淀试验 在小口径内先加入已知抗血清，然后小心沿管壁加入待检测抗原于血清表面，使之成为分界清晰的两层。数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。琼脂免疫扩散试验 琼脂高温能溶解，冷却后
5、凝固，形成凝胶，琼脂凝胶呈多孔结构，其内充满水分，因此各种抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散，扩散抗体在凝胶中扩散，当二者在比例适当处相遇，即发生沉淀反应标记抗体技术标记抗体技术l抗原抗体分子小，在含量低时形成的复合物是不可见的，但一些物质即使在超微量时也能通过特殊方法将其检查出来，如果将这些物质标记在抗体分子上，可以通过检测标记分子来显示抗原抗体复合物的存在，根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术l指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法FITC（罗丹明）分子中含有异硫氰基，在碱性条件下能与I
6、gG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体抗体经荧光标记后，并不影响其结合抗原的能力和特异性，因此当荧光抗体与相应抗原结合时，就形成带有荧光的抗原抗体复合物，从而在荧光显微镜下检测出抗原的存在酶标抗体技术酶标抗体技术l根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。酶是一种有机催化剂，催化反应过程中不被消耗，能反复作用，微量的酶即可导致大量的催化过程基本程序 将酶分子与抗原或抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的催化活性 将此酶标抗体（抗抗体）与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原（抗体）发生特异性结合，并洗下未结
7、合物质 滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色 免疫酶组化染色技术 酶联免疫吸附试验（ELISA）中和试验中和试验l根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验l主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清的质量评价和测定动物血清抗体的检测等l基本过程：先将抗血清与病毒混合，经适当时间作用后，然后接种于宿主系统以检测混合液中的病毒感染力。最后根据其产生保护效果的差异，可判断该病毒是否已被中和，并根据一定方法计算中和的程度，即代表中和抗体的效价第十五讲第十五讲 疫苗与免疫预防疫苗与免疫预防免疫预防 通过应用疫苗免疫的方法使动物具有针对某
8、种传染病的特异性抵抗力，以达到控制疾病的目的天然获得性免疫指个体动物本事未经疫苗免疫接种，而具有的对某些疫病的特异性抵抗力，包括天然被动免疫和天然主动免疫。人工获得性免疫指人为对动物进行免疫接种，使动物具有对某种抗原的特异性免疫力，包括人工被动免疫和人工主动免疫获得性免疫天然获得性免疫天然被动免疫（母源抗体）天然主动免疫（自然感染）人工获得性免疫人工被动免疫（免疫血清）人工主动免疫代谢产物（类毒素）生物技术疫苗死疫苗活疫苗天然被动免疫天然被动免疫：新生动物通过母体胎盘、初乳或卵黄从母体获得某种特异性抗体，从而获得对某种病原体的免疫力 意义：1.保护胎儿免受病原体的感染 2.抵御幼龄动物传染病天
9、然主动免疫天然主动免疫：动物在感染某种病原微生物耐过后产生的对该病原体再次侵入的不感染状态，或称抵抗力人工被动免疫人工被动免疫：将免疫血清或自然发病后康复动物的血清人工输入未免疫的动物，使其获得对某种病原的抵抗力。如草鱼出血病鱼的血清可防治草鱼出血病。人工被动免疫注射免疫血清可使抗体立即发挥作用，无诱导期，免疫力出现快。用同种动物制备的血清称同种血清，用异种动物制备的血清称异种血清异种血清（如抗毒素）的制备一般经一定处理，如用类毒素免疫动物，获取含高效价抗毒素的血清，用饱和硫酸铵处理，使抗毒素免疫球蛋白部分得到浓缩和提纯。类毒素类毒素：细菌的外毒素经甲醛或其他方法处理后，毒力减弱或丧失但仍保持
10、免疫原性，称人工主动免疫人工主动免疫：给动物接种疫苗，刺激机体免疫系统发生应答反应，产生特异性免疫力。人工主动免疫不能立即产生免疫力，有一定的诱导或潜伏期，出现免疫力的时间与抗原种类有关。群体免疫力：是指在动物群体中，由于存在着一定比例的免疫动物，使整个动物群具有对某种疾病的抵抗力。全微生物疫苗活疫苗有弱毒疫苗和异源疫苗弱毒疫苗：毒力减弱，仍保持着原有的抗原性，并能在体内繁殖，较少的免疫剂量诱导产生坚实的免疫力，不需佐剂，免疫期。异源疫苗：用具有共同保护性抗原的不同病毒制备成的疫苗，如用鸽痘病毒预防鸡痘等。灭活疫苗：病原微生物经理化方法灭活后，仍保持免疫原性，接种后使动物产生特异性抵抗力特点：在机体内不能繁殖，使用接种剂量较大，免疫期短，需加入适当佐剂以增强免疫效果。优点：研制周期短、使用安全和易于保存组织灭火疫苗包括病变组织灭火疫苗和鸡胚组织灭火疫苗两种。提纯的大分子疫苗类毒素疫苗 将细菌外毒素经甲醛脱毒，使其失去致病性而保留免疫原性的制剂，如破伤风类毒素，白喉毒素亚单位疫苗 此类疫苗是从细菌或病毒粗抗原中分离提取某一种或几种具有免疫原性的生物活性物质，除去免疫不必需的“杂质”，从而使疫苗更为纯净。如将病毒的衣壳蛋白与核算分开、除去核酸用提纯的蛋白质衣壳制成的疫苗
