1、 第十七章第十七章HLAHLA分型检测技术分型检测技术 主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)：指脊椎动物某一染色体上编码主要组织相容性抗原、控制细胞间免疫识别、调节免疫应答的一组紧密连锁的基因群。主要组织相容性抗原(major histocompatibility antigen，MHA)：MHC编码的基因产物，存在于所有有核细胞的表面。能引起快而强的排斥反应。人类MHC：HLA复合体 位于第6号染色体短臂上。人类的主要组织相容性抗原HLA（human leukocyte antigen，人类白细胞抗原）代表个体组织特异性的、引起强烈
2、而讯速器官移植排斥反应的同种异型抗原。首先发现于白细胞表面，且白细胞是进行此类抗原研究的最适宜材料来源。位置位置第第6 6号染色体短臂，约长号染色体短臂，约长4000kb4000kb基因组成基因组成自着丝点起，依次为自着丝点起，依次为类基因、类基因、类基因、类基因、类基因类基因类类基基因因经典经典HLA-AHLA-AHLA-BHLA-BHLA-CHLA-C编码分子编码分子HLA-AHLA-A分子分子HLA-BHLA-B分子分子HLA-CHLA-C分子分子功能功能参与内源性抗原递呈和免疫调控参与内源性抗原递呈和免疫调控非经典非经典HLA-EHLA-EHLA-FHLA-FHLA-GHLA-G编码分
3、子编码分子HLA-EHLA-E分子分子HLA-F分子分子HLA-G分子分子功能功能参与免疫调控参与免疫调控类类基基因因经典经典HLA-DPHLA-DPHLA-DQHLA-DQHLA-DRHLA-DR编码分子编码分子HLA-DPHLA-DP分子分子HLA-DQHLA-DQ分子分子HLA-DRHLA-DR分子分子功能功能参与外源性抗原递呈和免疫调控参与外源性抗原递呈和免疫调控抗原加工抗原加工相关基因相关基因HLA-DMHLA-DMHLA-DOHLA-DOTAP1TAP1TAP2TAP2LMP2LMP2LMP7LMP7编码分子编码分子HLA-DMHLA-DMHLA-DOHLA-DO分子分子TAP1T
4、AP1TAP2TAP2分子分子LMP2LMP2LMP7LMP7分子分子功能功能参与抗原加工递呈参与抗原加工递呈LMP（low molecular weight peptide）低分子量多肽基因低分子量多肽基因包括包括LMP2LMP2和和LMP7LMP7两基因，两基因，编码产物蛋白酶编码产物蛋白酶LMP2LMP2和和LMP7LMP7，参与内源性，参与内源性抗原的加工抗原的加工TAP（transporter associated with antigen processing）抗原加工相关转运体基因抗原加工相关转运体基因包括包括TAP1TAP1和和TAP2TAP2两基因两基因编码产物编码产物TAP
5、TAP分子参与内源性抗原肽的转运分子参与内源性抗原肽的转运HLA-HLA-类基因类基因位于位于HLA-HLA-、类基因类基因之间之间补体基因补体基因C4AC4A、C4BC4B、C2C2、BfBf21-21-羟化酶基因羟化酶基因CYP21ACYP21A、CYP21BCYP21B热休克蛋白基因热休克蛋白基因HSP70HSP70细胞因子基因细胞因子基因TNFTNF、LTALTA、LTBLTB HLAHLA复合体的遗传特点复合体的遗传特点单元型遗传单元型遗传共显性表达共显性表达高度多态性高度多态性连锁不平衡连锁不平衡 共显性表达（共显性表达（Codominance）两条同源染色体两条同源染色体上的一对
6、等位基上的一对等位基因共显性表达，因共显性表达，都能编码相应的都能编码相应的分子分子 高度多态性高度多态性（Polymorphism）多态性多态性 一群体概念，指一随机婚配的人群中，在一一群体概念，指一随机婚配的人群中，在一特定基因座位上以稳定频率出现的两种或两特定基因座位上以稳定频率出现的两种或两种以上的基因产物种以上的基因产物 复等位基因复等位基因 共显性表达共显性表达 The numbers of HLA alleles currently officially assigned by the WHO Nomenclature Committee for Factors of the H
7、LA System as of August 2000.Polymorphism in MHC Class I genes555291140Data from www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html October 2003998 alleles(657 in July 2000)6215Class IABCNo ofpolymorphismsEFGPolymorphism in MHC Class II genes3356201062556Data from www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html October 2
8、003668 alleles(492 in July 2000)764688DRDPDQDMDOClass IIAB1A1B1B2-9 A1B1No ofpolymorphismsABAB 连锁不平衡连锁不平衡（Linkage disequilibrium）指在某一群体中，不同座位上某两个基因出现指在某一群体中，不同座位上某两个基因出现在同一条单元型上的频率与期望值之间有显著在同一条单元型上的频率与期望值之间有显著差异的现象差异的现象HLA-DRB1HLA-DRB1*09010901基因频率基因频率15.6%15.6%HLA-DQB1HLA-DQB1*07010701基因频率基因频率21.9%
9、21.9%连锁理论频率连锁理论频率3.4%3.4%（0.1560.1560 0.219.219）连锁实际频率连锁实际频率11.3%11.3%HLAHLA的多态性通过一系列特异性抗体确定。的多态性通过一系列特异性抗体确定。检测方法有检测方法有血清学分型、细胞学分型和分子血清学分型、细胞学分型和分子生物学分型方法生物学分型方法。HLAHLA分型使分型使HLAHLA复杂的多态性更得以显露，推复杂的多态性更得以显露，推动了动了HLAHLA与群体及自然选择关系的研究，促进了对与群体及自然选择关系的研究，促进了对疾病本质的认识。疾病本质的认识。HLAHLA分型应用于器官移植、法医鉴定、遗传学分型应用于器官
10、移植、法医鉴定、遗传学研究探讨与疾病的相关性等领域。研究探讨与疾病的相关性等领域。一、原理：抗原抗体反应一、原理：抗原抗体反应方法：方法：微量淋巴细胞毒试验或称补体依赖的细微量淋巴细胞毒试验或称补体依赖的细胞毒试验胞毒试验(micro-complement dependent cytotoxicity，CDCCDC)分型抗原分型抗原：SDSD抗原抗原(serologically defined antigenserologically defined antigen)，包括，包括HLA-AHLA-A、B B、C C、DRDR、DQDQ。第一节第一节 HLA血清学分型法血清学分型法CDC试验原理
11、：当特异性抗体与淋巴细胞表面HLA分子结合，激活补体，使细胞溶解。在显微镜下可见细胞被活性染料着色。标准血清标准血清+淋巴细胞淋巴细胞 抗原抗体复合物抗原抗体复合物+补体补体 溶解细胞溶解细胞+染料（台盼蓝、伊红）染料（台盼蓝、伊红）计数死细胞数计数死细胞数微量细胞毒试验判定标准微量细胞毒试验判定标准死死(着染着染)细胞细胞%记分记分 结果判断结果判断0101阴性阴性11202可疑阳性可疑阳性21504弱阳性弱阳性51806阳性阳性80 8 强阳性强阳性 未试验或不能读数未试验或不能读数 二、技术要点二、技术要点 1 1CDCCDC试验的关键在于获得标准抗血清。试验的关键在于获得标准抗血清。与
12、与ABOABO血型抗体不同，主要获自经产妇。血型抗体不同，主要获自经产妇。2 2抗血清种类应覆盖本民族、本地区抗血清种类应覆盖本民族、本地区8080以上以上 的抗原。其中每一高频的抗原。其中每一高频3 3份以上，低频份以上，低频2 2份以上。份以上。3 3类抗原，仅分布于类抗原，仅分布于B B细胞或巨噬细胞表面，细胞或巨噬细胞表面，故检测故检测类抗原应分纯类抗原应分纯B B细胞。细胞。4 4、注意下列假象、注意下列假象 粒细胞和单核细胞能够非特异性地吞噬染粒细胞和单核细胞能够非特异性地吞噬染 料而造成着染假象，应注意细胞形态的区别。料而造成着染假象，应注意细胞形态的区别。血小板与淋巴细胞竞争，
13、结合血小板与淋巴细胞竞争，结合HLAHLA抗体而导抗体而导 致假阴性结果，可用玻璃珠脱纤维抗凝。致假阴性结果，可用玻璃珠脱纤维抗凝。红细胞沾染易致假阳性。红细胞沾染易致假阳性。单克隆抗体复合物不能激活补体，不能用于单克隆抗体复合物不能激活补体，不能用于 CDC CDC，可改用可改用ELISAELISA、FCMFCM。三、临床应用三、临床应用 1 1HLAHLA配型可用于器官移植与相关疾病的诊断研究。配型可用于器官移植与相关疾病的诊断研究。2 2HLAHLA交叉配型交叉配型 即用即用CDCCDC法检测受体血清有无针对供者法检测受体血清有无针对供者HLAHLA的抗体，的抗体，以监测排斥反应的发生或
14、估价受体的敏感性。以监测排斥反应的发生或估价受体的敏感性。3 3群体反应性抗体的检测群体反应性抗体的检测(Panel reactive antibodyPanel reactive antibody，PRA)PRA)PRAPRA用于判断器官移植时受体的敏感程度，可用用于判断器官移植时受体的敏感程度，可用40406060人混合人混合T T、B B细胞，检测受者血清抗体阳性百分数，高细胞，检测受者血清抗体阳性百分数，高PRAPRA血清受体对所接受的移植物构成威胁。血清受体对所接受的移植物构成威胁。方法方法：混合淋巴细胞培养混合淋巴细胞培养 (mixed lymphocyte culturemixe
15、d lymphocyte culture，MLCMLC)混合淋巴细胞反应混合淋巴细胞反应 (mixed lymphocyte reactionmixed lymphocyte reaction，MLRMLR)分型抗原分型抗原：LDLD抗原抗原(1 1ymphocyteymphocyte defined defined antigen antigen)：包括包括 HLA-DHLA-D、DPDP第二节第二节 细胞学分型法细胞学分型法MLCMLC试验方法试验方法：反应细胞（受者淋巴细胞）反应细胞（受者淋巴细胞）+刺激细胞刺激细胞（供者或已知标准株淋巴细胞）（供者或已知标准株淋巴细胞）不处理不处理双向
16、双向（丝裂霉素（丝裂霉素c c或或x x线照射预处理）线照射预处理）单向（目前仍使用）单向（目前仍使用）反应管反应管 混合培养混合培养观察反应细胞对刺激细胞发生应答、转化观察反应细胞对刺激细胞发生应答、转化 （涂片、染色、（涂片、染色、3 3H-H-TdRTdR刺激指数刺激指数SISI）结果与评价结果与评价：双向双向单向单向结果结果两细胞反应之和两细胞反应之和待检细胞的反应待检细胞的反应公式公式SI=2SI=2试验管试验管cpmcpm/(A+B)/(A+B)对照对照SI=试验管试验管cpm/自身对照自身对照评价评价反映两种细胞间反映两种细胞间LD的差别，的差别，不能作不能作LD抗原分型抗原分型
17、 可用于作可用于作HLA-D、DP分型分型 1阴性分型法阴性分型法 纯合子分型细胞试验纯合子分型细胞试验(homozygous typing cell，HTC)纯合子是指细胞内一对同源染色体上两纯合子是指细胞内一对同源染色体上两个个HLA单倍型完全相同，只表达一种单倍型完全相同，只表达一种LD抗抗原，可从近亲婚配的子代中寻找。原，可从近亲婚配的子代中寻找。试验：试验：将一组将一组HTCHTC作刺激细胞，作单向作刺激细胞，作单向MLCMLC。结果：结果：待检与刺激细胞的待检与刺激细胞的LDLD不同不同发生反应发生反应 待检与刺激细胞的待检与刺激细胞的LDLD相同相同不反应不反应 要找的就是相同细
18、胞故为阴性分型法。要找的就是相同细胞故为阴性分型法。SI2SI2，DNV(double normalized value)30 DNV(double normalized value)10%10%，受抗供，受抗供 还可进一步作还可进一步作T T、B B细胞淋巴细胞毒性交叉配型细胞淋巴细胞毒性交叉配型 细胞交叉配型阳性细胞交叉配型阳性视为移植的禁忌症视为移植的禁忌症 B B细胞交叉配型对于弱细胞交叉配型对于弱类抗体更敏感类抗体更敏感 2 2、流式细胞法交叉配型、流式细胞法交叉配型 (flow-flow-cytometrycytometry cross matching cross matchin
19、g，FCC)FCC)供者淋巴细胞供者淋巴细胞+受者血清受者血清 共育共育 用流式细胞仪检测用流式细胞仪检测 3 3、混合淋巴细胞培养、混合淋巴细胞培养 供受者淋巴细胞单或双向供受者淋巴细胞单或双向MLCMLC 检测检测HLAHLA类抗原相容性类抗原相容性 4 4、自身交叉配型、自身交叉配型（autocrossmatchingautocrossmatching）受者血清受者血清 受者细胞受者细胞 细胞毒试验细胞毒试验 若阳性可致与供者的若阳性可致与供者的交叉配型出现假阳性交叉配型出现假阳性 交叉配型交叉配型阳性表明受者预存抗供体的抗体阳性表明受者预存抗供体的抗体 作受体选择时：作受体选择时：组织
20、配型组织配型差，差，交叉配型交叉配型阴性，仍可移植阴性，仍可移植 组织配型组织配型好，好，交叉配型交叉配型阳性，不宜移植阳性，不宜移植 交叉配型常用于交叉配型常用于肾肾移植移植 而不用于心、肝、肺等而不用于心、肝、肺等 二、二、HLAHLA与与AID(AID(自身免疫性疾病）自身免疫性疾病）寻找与某些疾病相关的寻找与某些疾病相关的HLAHLA型别，研究其发型别，研究其发生的遗传背景，这些疾病中以生的遗传背景，这些疾病中以AIDAID居多居多胰岛素依赖性糖尿病：华人胰岛素依赖性糖尿病：华人DR9DR9，白人白人DR4DR4强直性脊柱炎：强直性脊柱炎：B27B27SLESLE：DR3DR3HLA分型的实际应用分型的实际应用三、三、HLA与输血反应与输血反应 非溶血性输血反应与患者血清中存在非溶血性输血反应与患者血清中存在HLA抗体相关，可用抗体相关，可用HLA分型法检测供者分型法检测供者HLA型别和型别和HLA抗体。抗体。四、四、HLA与法医鉴定与法医鉴定 HLA等位基因的多态性是个体的终生遗等位基因的多态性是个体的终生遗传标记，无血缘关系的人群中传标记，无血缘关系的人群中HLA表型完全表型完全相同者极罕见，在同一家族内相同者极罕见，在同一家族内HLA以单倍型以单倍型方式遗传，据此作亲子鉴定、法医鉴定。方式遗传，据此作亲子鉴定、法医鉴定。
