1、第一节第一节光谱分析技术光谱分析技术光谱分析（分光光度技术）：利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。特点：灵敏、快速、简便。是生物化学分析中最常用的分析技术。光谱分析技术分类一、吸收光谱分析法吸光度与透光度吸光度与透光度光照射到物质可发生折射、反射和透射,一部分光会被物质吸收，一部分光被溶液透过，另一部分光被散射。设入射光强度为I0，透射光强度为I，透射光强度与入射光强度的比值称为透光度透光度，也叫透射率，以T表示。在光谱分析中，常常用吸光度表示溶液对入射光的吸收程度。吸光度与透光度的关系是：吸光度等于透光度的负对数，用A表示
2、吸光度，有下列公式关系。kbcIIT100kbcTIIIITA1lglglglg00 该公式表明，当用一束单色光照射吸收溶液时，其吸光度与液层厚度及溶液浓度的乘积成正比。此即朗伯朗伯-比尔定律比尔定律。在朗伯-比尔定律中，比例常数k称为吸光系数。如果溶液浓度以物质的量的浓度表示时，此常数称为摩尔吸光系数（），它表示在一定波长下测得的液层厚度为1cm、溶液浓度c为1mol/L时的溶液吸光度值。如果溶液浓度以质量体积比表示时，此常数称为比吸光系数（），它表示当溶液浓度为1g/L、液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度值。摩尔吸光系数和比吸光系数 可相互换算。kbcTIIIITA1lglglg
3、lg00、Lambert-Beer定律的应用条件：Lambert-Beer定律适用 可见光、紫外光和红外光；适用均匀非散射的液态样品，固体气态等Lambert-Beer定律要求条件 1、入射光必须是单色光 2、被测样品必须是均匀介质 3、吸收过程中，吸收物质之间不发生相互作用4、Lambert-Beer定律的偏离现象 1.吸收定律本身的局限性 L-B 定律是一个有限的定律，只有在稀溶液中才能成立。2、仪器因素(非单色光的影响)3、化学因素 溶液中的溶质可因 c 的改变而有离解、缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而发生偏离 L-B 定律的现象。例:在水溶液中，Cr()的两种离子存在如下平衡 Cr
4、2O42-+H2O 2CrO42-+2H+Cr2O42-、CrO42-有不同的 A 值，溶液的 A 值是二种离子的 A 之和。但由于随着浓度的改变(稀释)或改变溶液的 pH 值，Cr2O42-/CrO42-会发生变化，使C总与 A总 的关系偏离直线。4.其它光学因素(1)散射和反射:浑浊溶液由于散射光和反射光而偏离 L-B(2)非平行光紫外紫外-可见分光光度法的原理可见分光光度法的原理 物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收 当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会被当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会被吸收吸收或被或被反射反射，不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度
5、是不同的，对某个波长的光吸收强烈，不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈，对另外波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。对另外波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收。一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收。物质呈现各种各样颜色，就是它们对可见光物质呈现各种各样颜色，就是它们对可见光中某些特定波长的光线选择吸收的结果。中某些特定波长的光线选择吸收的结果。待测管待测管 2 2 待测管待测管 1 1标准管标准管 试剂空白管试剂空白管 物质颜色和吸收光颜色的关系物质颜
6、色和吸收光颜色的关系 吸吸 收收 光光 物质颜色物质颜色 颜颜 色色 波波 长长(nm)黄黄 绿绿 紫紫 400 450 黄黄 蓝蓝 450 480 橙橙 绿绿 蓝蓝 480 490 红红 蓝蓝 绿绿 490 500 紫紫 红红 绿绿 500 560 紫紫 黄黄 绿绿 560 580 蓝蓝 黄黄 580 600 绿绿 蓝蓝 绿绿 600 650 蓝蓝 绿绿 红红 650 750 物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波长的光。我们可以利用测量物质对某种波长的光的吸收来了长的光。我们可以利用测量物质对某种波长的光的吸收来了解物质的结构特性。
7、解物质的结构特性。用经过分光后的不同波长的光依次透过该物质，通过测用经过分光后的不同波长的光依次透过该物质，通过测量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以波长为横量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，就可以得到该物质在测量波长坐标，吸光度为纵坐标作图，就可以得到该物质在测量波长范围内的吸收曲线。这种曲线体现了物质对不同波长的光的范围内的吸收曲线。这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力，称为吸收光谱。吸收能力，称为吸收光谱。紫外紫外-可见分光光度法的原理可见分光光度法的原理 入射光入射光透射光透射光 不同波长光不同波长光检测器检测器吸收光谱吸收光谱
8、 紫外紫外-可见分光光度法的原理可见分光光度法的原理 紫外紫外-可见分光光度法是利用物质对光的吸收光谱，对可见分光光度法是利用物质对光的吸收光谱，对物质进行定性分析或定量分析的方法。物质进行定性分析或定量分析的方法。按所吸收光的波长按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外为紫外-可见分光光度法。可见分光光度法。0.01nm 0.1nm 800nm 10m 500m 1cm 波长波长 200nm 400nm 2.5m 25m 1m 光谱光谱 可可区域区域 见见 射线射线 射线射线 紫外光紫外光 光光 红外光红外光
9、微波微波 无线电波无线电波分析分析 分光分光方法方法 射线射线 紫外分紫外分 光度光度 核磁共振核磁共振 射线光谱法射线光谱法 光谱法光谱法 光光度法光光度法 法法 红外光谱法红外光谱法 微波光谱法微波光谱法 光谱法光谱法紫外紫外-可见分光光度法的原理可见分光光度法的原理-定量分析定量分析 波长范围波长范围 吸光度吸光度最大吸收波长最大吸收波长 利用标准曲线法定量分析利用标准曲线法定量分析 在一定波长（在一定波长（maxmax）下测定某物质的标准系列溶液）下测定某物质的标准系列溶液的吸光度作标准曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由的吸光度作标准曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由标准曲线求得样
10、品溶液的浓度或含量。标准曲线求得样品溶液的浓度或含量。0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)。0.800.600.400.200.00Axcx（二）原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。即在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。常用的定量方法有：标准曲线法、标准加入法、内标法。1.标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程分别进行测定，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线上找出对应的
11、浓度。由于影响因素较多，每次实验都要重新制作标准曲线。2.标准加入法：把待测样本分成体积相同的若干份，分别加入不同量的标准品，然后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线，用直线外推法使工作曲线延长交横轴，找出组分的对应浓度。本法的优点是能够更好地消除样品基质效应的影响，较为常用。3.内标法：在系列标准品和未知样品中加入一定量样本中不存在的元素（内标元素），分别进行测定。以标准品与内标元素的比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据未知样品与内标元素的比值依曲线计算出未知样品的浓度。本法要求内标元素应与待测元素有相近的物理和化学性质。只适用于双通道型原
12、子吸收分光光度计。二、二、发射光谱分析法发射光谱分析法（一）火焰光度法1、火焰光度法的定义 火焰光度法是利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析的方法,用光电检测系统测量被测元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。它是一种简化的发射光谱分析法。样品中待测元素激发态原子的发射光强度与该元素浓度C呈正比例关系，即aC，式中a为常数，与样品组成、蒸发和激发过程有关。火焰光度法通常采用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标法火焰光度法是以火焰为激发光源。2、火焰光度法的特点快速：试样溶液于数分钟内可完成测定。准确：火焰光源稳定性高，干扰少，误差为25，可用于微量分析和常量分析。灵
13、敏：分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0110106 g。设备简单：被测试样易被火焰激发，产生的谱线较简单，且均在可见光区，故使谱线分离和测量的设备简单。应用:用于血液及尿液样品中钠、钾的测定。FP640火焰光度计火焰光度计火焰光度法分析示意图火焰光度法分析示意图1.光源系统光源系统2.光学系统光学系统3.检测系统检测系统（二）、荧光光度法1 荧光发生的机制 物质的分子吸收了照射光（如紫外线）的高能量后，处于基态最低能级的分子，被激发到第一电子激发态和其它电子激发态的各个振动能级。到达激发态的各个振动能级的分子，和周围的分子（如溶剂分子）碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周围的分子，自己降落
14、到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后，由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量。简言之：有些物质物质受到有较高能量的光（如紫外光）照射时，在吸收了某些波长的光后，会发射出不同波长和不同强度的光（光致发光），照射停止，发光亦随之消失，这种光称为荧光。利用荧光强度进行分析的方法，称为荧光法。在荧光分析中，待测物质分子成为激发态时所吸收的光称为激发光，处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光称为发射光。应用：荧光光谱分析法在生化检验领域应用广泛，大量具有生物意义的物质，如氨基酸、蛋白质、核酸、酶、辅酶、嘌呤、嘧啶等。三、透射和散射光谱分析法主要测定光线通过溶液混悬颗粒
15、后的光吸收或光散射程度，常用方法为比浊法，又可称为透射比浊法和散射比浊法。临床上多用于对抗原或抗体的定量分析。一、散射光谱分析法用单色光照射透明溶液时，大部分按原来方向投射，而一小部分则按不同的角度散射开来，该现象称为光的散射。（一）散射比浊法散射比浊法：散射比浊法是根据待验样品在凝固过程中散射光的变化来确定检测终点的。基本原理：一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时，遇到抗原-抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射的波长和抗原-抗体复合物的颗粒大小和多少密切相关，光强度与复合物的含量成正比。临床应用：散射比浊法是免疫比浊分析中最常用的一种方法。（二）透射比浊法基本原
16、理：当光线通过一定体积的溶液时，由于溶液中存在颗粒（抗原-抗体复合物）对光线的反射和吸收，引起投射光线的减少，投射光的透光率和粒子的量成正比，通过测定透射光的透光率来反映粒子的量的方法。临床应用：透射比浊法操作简便，灵敏度高，变异系数小，而且能在全自动生化分析仪上检测，常用于生化指标的检测。第二节第二节 电化学分析技术电化学分析技术电化学分析技术：利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法。一、电位分析法基本原理：利用电极电位和浓度之间的关系来确定物质含量的分析方法，表示电极电位的基本公式是Nernst方程式。离子选择性电极分析法是电位分析法中发展最为迅速、最为活
17、跃的分支。离子选择性电极分析法用离子选择电极直接电位法测定离子浓度，常用在多种体液（血、尿、唾液、脑脊液等）中Ca2+、K+、Na+、Cl-、F-和碳酸氢盐等离子测定。使用离子选择性电极电位分析法测定的是离子活度a，而一般分析中要求测定的是离子浓度c，二者关系为：afc，其中f为活度系数。第三节、干化学分析技术第三节、干化学分析技术干化学分析：指将液态样品如血浆、血清、尿液等置于含有试剂的固相载体上发生反应，依照反应结果测定样品中特定成分的浓度或活度的一项技术。一、干化学分析技术基本原理干化学技术普遍采用多层膜固相试剂技术，即干式化学的多层膜试剂载体，它集现代化学、光学、酶工程学，化学计量学和
18、计算机技术于一体。类型：1、反射光度法 2、差示电位法 3、荧光技术和竞争免疫技术的荧光反射光度法多层膜四、层析技术（一）层析技术的原理层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：固定相：大多是固体物质或是固定于固体上的成分。流动相：由水和各种溶媒组成（液体或气体）。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。（二）层析法分类按
19、层析原理还可将层析分为：1.凝胶层析 2.离子交换层析 3.高效液相层析 4.亲和层析液体气体液体液-液层析气-液层析固体液-固层析气-固层析1.凝胶层析：又称分子筛过滤或排阻层析等。固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度（移动速度）也不同。本法的优点是所用凝胶属于惰性载体，吸附力弱，操作条件温和，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果。常用的凝胶有SephadexG（葡聚糖凝胶）系列。凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。2.离子交换层析：采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离
20、子型化合物的方法。主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。3.高效液相层析：在经典液相层析法基础上，引进气相层析的理论而发展起来的一项新颖快速的分离技术。具有分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行、应用范围广等优点，对分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤其有利，根据流动相和固定相相对极性，高效液相色谱分析可分为正相和反相两种。4.亲和层析：利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲
21、和力的物质，才能被 固定相吸附结合，无关组分随流动相流出。改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。五、电泳分析在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。1.醋酸纤维素薄膜电泳：醋酸纤维素是指纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质吸附小，能消除电泳中出
22、现的“托尾”现象。具有分离速度快、样品用量小的特点，适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。2.凝胶电泳：以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子核酸。琼脂糖凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。3.等电聚焦电泳：等电聚焦（IEF）是利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术，特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，在区带电泳中分辨率最好。常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。4.毛细管电泳：利用电泳和电渗流的电动力学原理，在一种空芯的微小内
23、径的毛细管中进行混合物的高效分离技术。毛细管电泳可分为：毛细管自由溶液区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦电泳六、离心技术（一）离心技术的基本原理 离心技术是根据一组物质的密度和在溶液中的沉降系数、浮力等不同，用不同离心力使其从溶液中分离、浓缩和纯化的方法。离心技术分为制备离心技术和分析离心技术。制备离心技术主要用于物质的分离、纯化。分析离心技术主要用来分析样品的组成。（二）离心技术种类及在检验中的应用离心技术在生化检验中的应用主要有两方面：对悬浮液中颗粒的分离，如从全血中分离血清、血浆等；分离两种密度不同液相，如从有机溶剂和水的混合物中分离出有机相等。离心法的分类1.平衡离心法：可用来分离细
24、胞、细胞膜或细胞碎片。2.差速离心法：又称差级离心法，其原理是交替使用低速或高速离心，也可采用逐渐增加离心速度的办法，通过不断增加相对离心力使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。适合分离大小和密度差异较大的颗粒。由于分辨率不高，常用于定性分离手段之前的粗制品提取。3.密度梯度离心法：该法具有很高的分辨率，可以同时使样品中的各个组分得到分离。其做法是将样品放在密度梯度介质中进行离心。常用的梯度材料有蔗糖、甘油、KBr、CsCl等。密度梯度离心法可分为：（1）速率区带离心法：根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此
25、分离的目的。一般用于分离大小相异而密度相同的物质。（2）等密度区带离心法：离心前预先配制介质的密度梯度，待分离的样品铺在梯度液顶部或与梯度液混合，当梯度液由于离心力作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，同时，原来分布均匀的粒子也发生重新分布。此法常用于分离大小相似而密度差异较大的物质。4.分析性超速离心：主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，如测定大分子的相对分子量、生物大分子的纯度估计、分析生物大分子中的构象变化等1、DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2、退火（60-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3、延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳梯度PCR仪）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3端开始以从53端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。第七节第七节 基因扩增技术基因扩增技术PCR：又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。原理：利用DNA聚合酶等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。
