1、人冠状病毒病原学与实验室检测人冠状病毒病原学与实验室检测冠状病毒（冠状病毒（coronavirus)概述：1933年，Baudette等描述了鸡的“哮喘病”，1937年首次从小鸡体内分离出冠状病毒，分离的病毒被鉴定为传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis,IBV);1951 年，Gledhill等分离出鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus,MHV)；1965年，Tyrrell和 Bynoe首次在体外用人胎鼻和气管培养方法，从普通感冒病人鼻洗液中分离出一株病毒，命名为B814病毒。1966年，Hamre 和Procknow用人胚肾细胞分离到类似病毒，代
2、表株命名为229E病毒。1967年，Mclntosh等用人胚气管培养从感冒病人中分离到一批病毒，其代表株是OC43（OC代表 organ culture）。随后证明，OC和229E病毒。1968年，June Almeida和Tyrrell对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒。1975年，国际病毒命名委员会（International Committee on the Taxonomy of Viruses,ICTV）正式命名了冠状病毒科（coronaviride)致病性：人冠状病毒常引起 1)普通感冒、是轻型感染。2)
3、腹泻或胃肠炎。3）下呼吸道感染或肺炎X1X2X3X4X5NME20,00130,0000.51.01.52.02.53.04.05.06.09.025,000SRNA 6123kBRNA 5RNA 4RNA 3RNA 28.3 kb4.5 kb3.4 kb2.5 kb1.7 kbSORF 1bORF 1aNMEABC15,00010,00015,00020,00025,00030,000HCoV 基因组与mRNAHCoVs为最大单股正链为最大单股正链RNA病毒，独特的胞浆内非连续性转录模式，易于发病毒，独特的胞浆内非连续性转录模式，易于发生基因组的变异与重组生基因组的变异与重组SARS-CoV
4、 中国大陆中国大陆 全中国全中国 全世界全世界发病发病 5327 发病发病 7429 发病发病 8096死亡死亡 349 死亡死亡 685 死亡死亡 774涉及世界涉及世界29个国家和地区个国家和地区2002年冬2003年春始发于我国广东，而后蔓延至我国大部分省市，并波及世界29个国家和地区。2003年4月16日，世界卫生组织宣布，严重急性呼吸综合症是由一种从未引起人类疾病的新型冠状病毒所致，这种新的病毒被命名为SARS-Coronavirus(SARS-CoV)SARS (severe acute respiratory syndrome)严重急性呼吸综合征严重急性呼吸综合征2121世纪新出
5、现的传染病世纪新出现的传染病 在SARS-CoV发现后，又有三种新的引起呼吸系统疾病的HCoV（HCoV-NL63，HCoV-HKU1与HCoV-2012）被相继发现，引起人类呼吸道疾病的HCoV（包括SARS-CoV）已有6种，急需研发这类疾病诊断和鉴别诊断的新技术。继继SARS-CoV后后,新新HCoV病原的发现病原的发现HCoV-2012冠状病毒冠状病毒 NL63 van der Hoek et al.,2004.Nat.Med.10:368-373 最初从一名七月龄的，因发烧、细支气管炎和结膜炎入院的患儿中分离。在Hela和TMK细胞中检测到细胞毒效应CPE。随机扩增，分离出特异性片段
6、，经测序证明是一种新的呼吸道病毒。NL63的特异性RT-PCR检测儿童的 NPA为阳性。回顾性的分析从2002年12月到2003年2月中测序的呼吸道样本中，有7例阳性标本。其中五个患儿是4-6月龄，两个患者,分别是40岁和67岁。冠状病毒冠状病毒 HKU1 Woo et al.,2005.J.Virol.79:884-895 从一名71岁的患有肺炎的老人中分离出来。该患者吸烟，并患有慢性阻塞性肺病。临床症状：发烧，咳嗽，脓性痰，胸肺X光片显示有斑点浸润。常规病毒学检测呈阴性。RT-PCR 确定是一种新的冠状病毒。回顾性筛选400份NPA样本，有一例是阳性，患者是一名35岁的妇女，患有肺炎。定量
7、 RT-PCR：1.1 x 106 copies/mL北京儿童医院重症下呼吸道北京儿童医院重症下呼吸道感染感染婴幼儿呼吸道病毒的检婴幼儿呼吸道病毒的检测测2008-2010年，采集住院病人鼻咽拭子370份，应用xTAG RVP Panel 试剂盒试剂盒进行多种呼吸道病毒检测。样品检出阳性率：样品检出阳性率：96.22%检测结果表明，感染率较高的病毒分别为：Piconavirus：54.05%RSVB：46.49%Bocavirus：33.78%PIV3:15.41%Adenovirus：12.97%HMPV：8.65%IFVA：7.03%HCoVs：6.76%xTAG Respiratory
8、Viral Panel Version1(RVP呼吸道病毒检测试剂盒)产品基于Luminex开放式结构平台，将xTAG 技术与xMAP 技术有效融为一体，可快速准确检测多种呼吸道病毒。已或美国FDA 批准临床应用l发热呼吸道症候群病原谱构成及其流行规律发热呼吸道症候群病原谱构成及其流行规律病原谱病原谱年龄分布年龄分布发热呼吸道症候群病毒病原原谱的时间趋势发热呼吸道症候群病毒病原原谱的时间趋势2012中东出现的新型冠状病毒中东出现的新型冠状病毒 近日，一名曾前往沙特旅游的卡塔尔男子被确认感染了一种新型冠状病毒，也一度被媒体称为类似SARS病毒。目前这名男子正在英国接受治疗，生命垂危。其肺部组织提
9、取的病毒与此前沙特曾出现的一个死亡病例相比，基因排序相似度为99.5%。两人的临床表现都是急性重症呼吸道感染合并急性肾衰竭。目前在全球只确认了这两个病例。还没有证据表明该病毒能够在人与人之间进行传播。新的冠状病毒和引起非典(严重急性呼吸系统综合征)的冠状病毒不同。Fig.Phylogenetic analysis based on 1a gene of coronaviruses and the new novel coronavirus基于已知序列的基于已知序列的系统发生分析系统发生分析213London1与Bat-CoV-HKU5序列比对 比对结果显示，London1与HKU5的相似性83
10、.2%London1与Bat-CoV-HKU4序列比对 比对结果显示，London1与HKU4的相似性82.7%Examples of bats and birds from which novel coronaviruses were discovered.Chinese horseshoe bat(Rhinolophus sinicus)(panel A),from which bat-SARS-CoV and bat-CoV HKU2 were discovered;Lesser bamboo bat(Tylonycteris pachypus)(panel B),from which
11、bat-CoV HKU4 was discovered;Leschenaults rousette(Rousettus lechenaulti)(panel C),from which bat-CoV HKU9 was discovered;A model of coronavirus evolutionCoVs in bats are the hypothesized gene pool of group 1 and group 2 CoVs and CoVs in birds are the hypothesized gene pool of group 3 CoVs.急性呼吸道感染诊断急
12、性呼吸道感染诊断 临床诊断 非特异性实验室检测 X-光检测 特异性实验室检测 呼吸道及血清样本用来:抗原检测 病毒分离 核酸扩增 病毒分离病毒分离:金标准金标准 抗原检测抗原检测:迅速，敏感迅速，敏感血清学抗体检测：血清学抗体检测：IgM检测检测;IgG检测检测:需要两个样本需要两个样本 中和试验中和试验核酸检测：核酸检测：快速敏感快速敏感病毒诊断学病毒诊断学 潜伏期潜伏期 1-121-12 天天,平均平均 5-65-6 天天,潜伏期内无传染潜伏期内无传染性性,发病发病 即有传染性即有传染性 若将一个传染周期定在若将一个传染周期定在 5-6 天天(平均潜伏期平均潜伏期),发发病病 5 天内能确
13、诊病人天内能确诊病人,则可能将疫情有效控制在则可能将疫情有效控制在 2 代病人以内代病人以内实验室检测在实验室检测在SARS诊断中的重要作用诊断中的重要作用BSL-3 1 1SARSSARS诊断分类与标准诊断分类与标准（1 1）疑似病例疑似病例：对于缺乏明确流行病学依据，但具备其它：对于缺乏明确流行病学依据，但具备其它SARSSARS支持证据者，支持证据者，如临床表现和肺如临床表现和肺X X线变化等，线变化等，可以作为疑似病例可以作为疑似病例，需进一步进行流行，需进一步进行流行病学追访，并安排病原及血清学检查以求印证。对于有流行病学依病学追访，并安排病原及血清学检查以求印证。对于有流行病学依据
14、，有临床症状，但尚无肺部据，有临床症状，但尚无肺部X X线影像学变化者，也线影像学变化者，也应作为疑似病例。应作为疑似病例。（2 2）临床诊断病例临床诊断病例：对于有：对于有SARSSARS流行病学依据、相应临床表现和肺部流行病学依据、相应临床表现和肺部X X线线影像改变，并能排除其他疾病诊断者，可以作出影像改变，并能排除其他疾病诊断者，可以作出SARSSARS临床诊断。临床诊断。（3 3）确定诊断确定诊断：在疑似和临床诊断的基础上，若：在疑似和临床诊断的基础上，若分泌物或血清分泌物或血清SARS-CoV SARS-CoV RNARNA检测阳性，或血清（或血浆）检测阳性，或血清（或血浆）SAR
15、S-CoVSARS-CoV特异性特异性N N蛋白抗原检测阳蛋白抗原检测阳性，或血清性，或血清SARS-CoVSARS-CoV抗体阳转，或抗体滴度抗体阳转，或抗体滴度4 4倍及以上增高倍及以上增高，则可做，则可做出确定诊断。出确定诊断。SARSSARS的诊断标准的诊断标准呼吸道样本呼吸道样本 拭子或抽吸物 鼻咽拭子 气管、支气管深部灌洗，肺泡灌洗液 样本转移液常用检测方法常用检测方法 检测所需时间检测所需时间 检测结果的解释及意义检测结果的解释及意义病毒核蛋白（病毒核蛋白（N）抗）抗原原ELISA检测检测 小时小时发病发病1-10天（天（3-5天敏感）的血清样品，阳性有诊断意义。此方天敏感）的血
16、清样品，阳性有诊断意义。此方法比较敏感，用于早期诊断，方法稳定，受样品质量影响小。法比较敏感，用于早期诊断，方法稳定，受样品质量影响小。病毒核酸实时病毒核酸实时PCR检检测测 小时小时发病期发病期3-10天的咽、肛拭子及血清样品，多样品阳性有诊断意天的咽、肛拭子及血清样品，多样品阳性有诊断意义。此方法用于早期诊断，方法较稳定，比较敏感，但受样品义。此方法用于早期诊断，方法较稳定，比较敏感，但受样品质量影响大。质量影响大。病毒核酸常规病毒核酸常规PCR检检测测 小时小时同上，可用于核酸序列测定，核酸测序有诊断意义。此方法用同上，可用于核酸序列测定，核酸测序有诊断意义。此方法用于早期诊断，方法较稳
17、定，比较敏感，但受样品质量影响大。于早期诊断，方法较稳定，比较敏感，但受样品质量影响大。IgG和和IgM的的ELISA和和荧光检测荧光检测 小时小时发病发病10天左右的血清才能检出，天左右的血清才能检出，4倍升高或阳转有诊断意义。此倍升高或阳转有诊断意义。此方法用于中晚期诊断，方法较稳定。方法用于中晚期诊断，方法较稳定。中和抗体的检测中和抗体的检测3-5天天发病发病10-22天血清能够检出，天血清能够检出，4倍升高有诊断意义。此方法用于倍升高有诊断意义。此方法用于中晚期诊断，方法较稳定。中晚期诊断，方法较稳定。病毒分离病毒分离5-10天天发病发病1-10天，咽肛拭子及血清样品，阳性有诊断意义。
18、此方法天，咽肛拭子及血清样品，阳性有诊断意义。此方法用于中晚期诊断，爱样品影响大。用于中晚期诊断，爱样品影响大。诊断时期诊断时期 内内 容容 方方 法法 标标 本本 早期诊断血清抗原 ELISA,PCR 血清，鼻咽拭子发病 5 天以内 病毒核酸中期诊断病毒核酸 PCR,ELISA血清，鼻咽拭子发病10天以内 血清抗原 IFA,NT 粪便，肛拭，尿IgM,IgG&NAb晚期诊断 IgM,IgG&NAb ELISA,NT 血清，鼻咽拭子发病10天以上病毒核酸 PCR,IFA 粪便，肛拭，尿血清抗原 建议对不明原因重症肺炎常规进行血清建议对不明原因重症肺炎常规进行血清SARS-CoV N蛋白检测蛋白
19、检测 HCoV（2012）实验室检测实验室检测 近期曾往中东地区，出现上呼吸道感染后，如果症状加重，或呼吸困难，建议立刻就诊并进行实验室检测。WHO发布了临时病例定义来帮助各国加强针对这种新病毒的健康保护措施。基于目前发现的病例，分为“正在调查中的病人”、“可能病例”和“确诊病例”。病例的分类基于临床、流行病学和实验室检测指标。目前可进行分子检测（PCR与荧光定量PCR）London1_novel_CoV_2012_nsp12(partial)TATTAGTGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCACAATGACTAATCGCCAGTACCAT
20、CAGAAAATGCTTAAGTCCATGGCTGCAACTCGTGGAGCGACTTGCGTCATTGGTACTACAAAGTTCTATGGTGGCTGGGATTTCATGCTTAAAACATTGTACAAAGATGTTGATAATCCGCATCTTATGGGT(208 nt)lpartial nucleotide sequence of the viral polymerase(nsp12)系统发生分析系统发生分析HPA公布的结果，2012-9-25GenBank BLAST 比对结果1.2.London1_novel_CoV_2012_nsp12核苷酸序列与与核苷酸序列与与SARS-Co
21、V-Tor2 株相应区株相应区段同源性为段同源性为73.6%引物设计与应用起止位起止位点点引物对引物对引物序列引物序列(5-3)片段大片段大小小（bp）备注备注7208F-1R-1TGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTTACCCATAAGATGCGGATTATCAACA20126134F-2R-2ACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCTAGTACCAATGACGCAAGTCGCTCC10949荧光探针TZ1CTAATCGCCAGTACCATCAGTaqMan探针60荧光探针TZ2AGCACAATGACTAATCGCCATaqMan探针基于上述引物探针，我们已建立常规P
22、CR方法（F-1,R-1；PCR片段201bp)，半套式PCR方法(1stPCR:F-1,R-1;nested PCR:F-1,R-2；PCR片段127bp)两种荧光定量PCR方法（F-1,R-2，TZ1；或 F-2,R-2，TZ2)与其他人冠状病毒无交叉反应；可初步用于新型冠状病毒（2012）的实验室检测。引物设计与应用2引物对引物对引物序列引物序列(5-3)片段大小片段大小（bp）备注备注HKU4-f1HKU4-r1GACTAATCGTCAATATCACCACCCATTAAATGTGGACTC150Bat-CoV-HKU4检测HKU4-f2ACACCAGAAGAAGAAGAAGAC135（
23、HKU4-r1合用）Bat-CoV-HKU4检测HKU5-f1HKU5-r1GACTGTTGCCGCAGAAACGATCACCCATCAAGTGAGGATTA185Bat-CoV-HKU5检测HKU5-f1HKU5-r2GTGAGGATTATCAACATCCTTATAC170Bat-CoV-HKU5检测基于对London-1 Novel Coronavirus 已知序列与Bat-CoV-HKU多株序列比对，我们分别设计了两对针对HKU4和HKU5的引物及其套式引物，可分别用于Bat-CoV-HKU4和HKU5核酸特异性检测。巢式巢式PCRPCR普通普通PCRPCRPCRPCR产物电泳或测序产物
24、电泳或测序逆转录，获得逆转录，获得cDNAcDNA核酸提取核酸提取 荧光定量荧光定量PCRPCR 鼻咽拭子标本鼻咽拭子标本PCRPCR检测检测实验方案实验方案核酸核酸(基因基因)检测检测基因扩增基因扩增(PCR)靶序列模板DNA35个循环个循环340亿亿 拷贝拷贝标本中存在病毒核酸，但不一定存在活病毒标本中存在病毒核酸，但不一定存在活病毒 可以确定存在感染可以确定存在感染PCR产物可以测定核苷酸序列，确定病原需要较好的经验产物可以测定核苷酸序列，确定病原需要较好的经验冠状病毒检测通用引物对冠状病毒检测通用引物对:Cor-FW(5-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3)Cor-RV
25、(5-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3)冠状病毒通用引物RT-PCR扩增产物电泳One-step RT-PCR assays(OneStep RT-PCR kit;QIAGEN)a 50 l reaction volume containing 10 L RNA-extract,10 l 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer,2 l dNTP mix(final concentration of 400 M of each dNTP),1.8 l QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix(a combination of Omnis
26、cript and Sensiscript reverse transcriptase and Hot-StarTaq DNA polymerase),4 M of each primer,and RNase-free water to 50 l.The reaction was carried out with an initial reverse transcription step at 50C for 30min,followed by PCR activation at 95C for 15 min,50 cycles of amplification(30 sec at 94C;3
27、0 sec at 48C;1min at 72C),and a final extension step at 72C for 10min定量定量 PCR，TaqMan体系体系 ABI 公司首先推出公司首先推出(PRISM 7000系列系列)。实时检测实时检测:每个循环都会产生与每个循环都会产生与PCR产物产物成正比的荧光物质成正比的荧光物质定量定量RT-PCR检测检测试剂盒：试剂盒：Real-Time One-Step RT-PCR Master Mix(Applied Biosystems).25-L 反应体系含：反应体系含：12.5 L of 2X Master Mix,0.625 L
28、of the 40X MultiScribe and RNase Inhibitor mix,0.25 L of 10 M probe,0.25 L each of 50 M forward and reverse primers,6.125 L of nuclease-free water,and 5 L of nucleic acid extract反应条件：反应条件：30 min at 48C（反转录）,10 min at 95C；45 cycles of 15 s at 95C and 1 min at 60C.对照设置：对照设置：HCoV 阳性模板；2个阴性模板（核酸提取开始）；无模板对照（PCR-扩增步骤）.阳性结果判读阳性结果判读:对照成立条件下，CT 45 cycles后续工作后续工作 代获得全基因组序列后，进行进一步分析与引物优化设计验证，研制更好的分子检测试剂 表达纯化结构抗原，制备单克隆抗体，研制免疫学检测试剂 结合感染病例及相关样品，确定实验室检测规程。SARS是否会再次出现？是否会再次出现？?研究表明，SARS-CoV是动物中SARS样冠状病毒在反复与人接触中跨种属突变后产生的。但对其原始宿主、中间宿主，以及如何跨种属突变造成人间流行尚不十分清楚，SARS再次出现的威胁依然存在！
