1、 ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子标记技术 主讲人：关主讲人：关 锰锰分子标记的概念分子标记的概念 n广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。n蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。n狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳：能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片片 段，它直接反映基因组段，它直接反映基因组DNA间的差异
2、。间的差异。分子标记的特点分子标记的特点（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。分子标记的类型分子标记的类型基于杂交的分子标记基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction fragment length polymorphism,即限制性长度片段多态性）。基于 DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（Single
3、 nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）。基于基于 PCR的分子标记的分子标记，它又分为两类：RAPD（Random amplified polymorphic DNA）DAF（DNA amplification fingerprinting）SSCP（Single strand confirmational polymorphism）小卫星小卫星DNA（Minisatellite DNA）微卫星微卫星DNA（Microsatellite DNA）,又称SSR（Simple sequence repeat）ISSR（Inter simple sequence repe
4、at）AP-PCR（Arbitrary primer PCR）它主要有SCAR（Sequence characterized amplified region）STS(Sequence tagged site)位点特异的位点特异的PCR标记方法标记方法多位点标记方法多位点标记方法基于基于PCR技术的技术的DNA扩增方法扩增方法 AFLP（Amplified fragment length polymorphism）AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增 CAPS（Cleaved amplified polymorphic sequence）CAPS是先扩增，再酶切扩增片段PCR与酶切相结
5、合的方法与酶切相结合的方法微卫星微卫星DNA Microsatellite，MS/Simple Sequence Repeat,SSR 短的，简单的串联重复序列；基元是1-6个碱基(有的定义为1-5个碱基)；广泛存在于真核细胞整个基因组的不同位置上；高度多态性(微卫星DNA长度的多态性)；微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列；共显性标记。特点特点ISSR原理简介原理简介nISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年在微卫星基础上发展起来的一种新的分子标记。其基本原理是:用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3端或5端加上
6、2-4个随机核昔酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的两个SSR区域之间的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特别丰富，因而可以检测到高的多态性。ISSR分子标记的特点分子标记的特点n优点：优点：ISSR 标记结合了RAPD 和SSR 的优点,所需DNA模板的量少、多态性丰富,无需试剂盒、结果记录方便、实验成本低、操作简单、稳定性较高、呈孟德尔式遗传 n缺点：缺点：是PCR 扩增时最适反应条件需要一定时间摸索,其标记大多为显性标记,在解决交配系
7、统、计算杂合度和父系分析等问题时效果不佳 特性特性RFLPRAPDSSRISSRAFLP分布 普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在遗传共显性多数显性共显性多数显性多数显性多态性中高高高非常高等位检测是不是是不是不是检测位点数1311015050更多20100样品信息量低中高高高非常高基因组区域底拷贝编码整个基因组整个基因组整个基因组整个基因组技术难度中等简单简单简单中等重复性高中等高高高DNA样品量230g1100ng50-100ng250ng100ng耗费时间慢快快快中等可靠性高中等高高高ISSR实验流程实验流程DNA提取及检测提取及检测 引物设计引物设计PCR扩增扩增电泳检测电泳检测结
8、果统计及分析结果统计及分析必须对扩增条件进行优化，包括对Tag酶、引物浓度及其退火温度、M g 2+浓度、模板浓度等。引物设计是 ISSR技术中最关键、最重要的一步。基因组中SSR 一般为 26个寡聚核苷酸，用于ISSR的引物常为 5或 3端加锚定的二核苷酸、三核苷 酸、四核苷酸重复序列，重复次数 一般为48 次，使引物的总长度达到 1618bp。5或 3端用于锚定的碱基数目一般为 14个，锚定的目的是引起特定位点退火，使引物与相匹配 SSR的一端而不是中间结合，从而对基因组中特定片段进行扩增、检测。由于植物基因组中SSR最多的 是(AT)n、(TA)n、(GA)n、(CT)n等二核苷酸重复序列，在选择 ISSR引物时，应以二核苷酸重复序列为主，少选寡聚三核苷酸、四核苷酸引物。PCR 产物需经电泳分离、染色显示后才能进行谱带观察、统计。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前通用的两种电泳技术。一般采用1.5%-2%的琼脂糖凝胶电泳或5%-8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者EB 染色紫外光下观察、拍照；后者经银染可见光下观察记录，拍照。一般当琼脂糖电泳分离效果不理想时采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。谱带统计分析采用相关软件NTSYS 或PAUG。应用领域应用领域 种质资源鉴定 遗传作图 基因定位 遗传多样性 系统与进化 分子生态学
