1、1分子生物学常用检测技术分子生物学常用检测技术及临床应用及临床应用2精品资料4 你怎么称呼老师？如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”5DNADNA四种核苷酸（四种核苷酸（A-T-C-G)A-T-C-G)组成组成的多聚骨架的多聚骨架所有组成所有组成DNADNA的核苷酸的核苷酸dATP,dTTP,dCTP,dGTPdATP,dTTP,dCTP,dGTP都由三种成分组成：都由三种成分组成：1 1）一个）一个2
2、2-脱氧核糖（戊糖）脱氧核糖（戊糖）2 2）一个含氮碱基）一个含氮碱基 嘌呤：嘌呤：AG AG 嘧啶：嘧啶：T/CT/C3 3）三个磷酸基团）三个磷酸基团各单个核苷酸由各单个核苷酸由5 5和和3 3-碳形碳形成的磷酸二酯键连接在成的磷酸二酯键连接在一起一起6变性、复性、退火和淬火7基因8分子生物学常用技术 PCR（聚合酶链式反应）核酸分子杂交 基因芯片技术(biochip)DNA 测序（DNA sequencing）DNA重组技术(DNA recombination)9 一、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）体外基因扩增技术体外基因扩增技术 特异性强灵敏
3、度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术10（一）PCR原理原理双链DNA 变性 退火 链延伸 （膜板）（双链分成单链）（膜板与引物杂交）（DNA合成）不断重复11（二）（二）PCR反应的设计及影响因素反应的设计及影响因素12PCR的种类荧光定量PCR通用引物PCR多重PCR巢式PCRRT-PCR原位PCR免疫PCR13TaqManTaqMan探针reverse primerRQforward primer33553551.PolymerisationprobeRQ33553552.Strand displacementQ33553553.CleavageR3553554
4、.Polymerisation completedQRR=ReporterQ=Quencher3荧光定量PCR14定量定量PCRPCR的数学原理的数学原理PCR 理理 论论 方方 程程N=N0 x(1+E)nN：扩增数量扩增数量N0：起始模板数量起始模板数量E：扩增效率扩增效率N：循环数循环数 循环数循环数线性增长期Linear平台期Plateauy=N0(1+e)n指数增长期指数增长期GeometricGeometric15定量定量PCRPCR的数学原理的数学原理Rn(荧光强度)循环数Cycle Number指数增长期平台期CT=-k logN0+bCt（Cyclethreshold）值：是
5、指每个反应管内的荧光信号到达设定域值（threshold）时所经历的循环数。16PCR的临床应用的临床应用l 对病原微生物核酸进行快速检测l 弥补免疫检测的缺陷l 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV）l 用于药物疗效监测和评估l 用于肿瘤基因表达方面的研究l 用于遗传病的诊断17样本采集要求1819二、核酸分子杂交根据根据核酸变性和复性核酸变性和复性的原理的原理，不同来源的，不同来源的变性单链核酸分子在变性单链核酸分子在合适的条件下，通过合适的条件下，通过碱基互补碱基互补形成双链杂形成双链杂交体的过程称为交体的过程称为核酸核酸分子杂交分子杂交（molecular hybridization）。
6、）。20 1、遗传病的诊断 2、病原体的鉴定 3、癌基因突变的检测 4、组织配型 5、亲子鉴定核酸分子杂交的临床应用21三、基因芯片技术 基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等。22用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列原位合成法在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列23基因芯片技术的应用1、药物筛选和新药开发2、疾病诊断3、环境保护4、司法5、现代农业24四、测序技术CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT（一）一代测序技术25（二）二代测序技术 Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核
7、心原理是相同的。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。2627技术特点比较 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。28五、基因重组技术 基因重组是指一个基因的DNA序列是由两个或两个以上的亲本DNA组合起来的。基因重组是遗传的基本现象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重组现象。29 转基因植物（抗虫、抗冻、抗病、高产）转基因动物 基因工程药物和疫苗 基因治疗基因重组技术的应用30小结 疾病的诊断 感染性疾病诊断 肿瘤性疾病诊断 遗传性疾病诊断 组织配型和器官移植 基因治疗 基因工程产品 转基因植物 转基因动物 基因工程药物和疫苗 法医学方面分子生物学技术的临床应用用途广泛用途广泛功能强大功能强大31基因工程的危险性基因工程的危险性
