1、BDNF、NT-3在针刺促进脊髓可塑在针刺促进脊髓可塑性中的作用性中的作用导导 师：师：xxxxxx研究生：研究生：xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx一一 引言引言1 脊髓损伤：脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是神经系统疾患的一大难题，它具有高发生率、高致残率、高耗费、低死亡率等特点。研究脊髓损伤的修复及其机理，寻求治疗脊髓损伤的有效手段，从结构和功能上促进损伤神经组织的修复及功能重建，具有十分重要的现实意义。2 脊髓具有可塑性：1958年，Liu和Chambers首次证实脊髓具有可塑性，突破了过去认为central nervous system(CNS)是一成不
2、变的观念，使人们对CNS有了新的认识(Liu.1958)。随后，国外广大学者应用溃变染色法、超微结构定量法、辣根过氧化物酶（HRP)逆行追踪法及组织化学法(Goldberger.1974-Wu.1986)等手段进一步证实脊髓具有可塑性现象。国内吴建中、赵忠球等为可塑性研究提供了不少形态学证据(吴建中.赵忠球 2002)。3 针刺促进脊髓可塑性在脊髓损伤方面，很多相关文献报道电针刺对脊髓损伤后运动以及感觉功能的恢复有良好的改善作用(陈之罡.1955-徐水凌.2004)，进而对脊髓可塑性有促进作用。4 针刺与神经营养因子电针刺可通过激活一些神经营养因子如NGF、BDNF、NT-3、GDNF、PDG
3、F或细胞即刻早期基因如c-fos/c-jun等的表达来参与脊髓可塑性和电针刺促进脊髓可塑性的过程(吴良芳.1994-Wang.2007)因此，为了提供哺乳动物脊髓可塑性及电针刺促进脊髓可塑性中更直观的形态学证据更直观的形态学证据本研究采用跨神经元形态学示踪和酶免疫组织化学方法，在光镜下观察和探讨备用背根中枢终末在猫脊髓内是否存在可塑性出芽现象，以及电针刺和使用BDNF、NT-3抗体封闭后这种出芽的差异变化.了解猫备用背根造模后脊髓可塑性中备用背根节神经元的出芽能力及其与电针刺和神经营养因子的关系，进而加深对脊髓可塑性和电针刺促进脊髓可塑性中神经营养因子作用的形态学方面的认识，以进一步丰富神经生
4、物学神经系统损伤修复的基础理论，为临床脊髓损伤修复的治疗提供一些形态学方面的支持和理论依据。二二 实验目的实验目的观察正常猫备用背根节神经元的纤维联系观察正常猫备用背根节神经元的纤维联系观察备用背根猫备用背根节神经元的纤维联系观察备用背根猫备用背根节神经元的纤维联系观察针刺后备用背根节神经元的纤维联系及出芽观察针刺后备用背根节神经元的纤维联系及出芽观察备用背根猫体内观察备用背根猫体内BDNF抗体封闭后备用背根节神抗体封闭后备用背根节神经元的纤维联系经元的纤维联系观察针刺在体内封闭观察针刺在体内封闭BDNF抗体后备用背根节神经元抗体后备用背根节神经元的纤维联系及出芽的纤维联系及出芽观察备用背根猫
5、体内观察备用背根猫体内NT-3抗体封闭后备用背根节神抗体封闭后备用背根节神经元的纤维联系经元的纤维联系观察针刺在体内封闭观察针刺在体内封闭NT-3抗体后备用背根节神经元抗体后备用背根节神经元的纤维联系及出芽的纤维联系及出芽三三 实验方法实验方法1.实验动物分组2.动物模型制备3.穴位选择和针刺方法4.实验所需仪器和试剂5.体内抗体封闭6.HRP示踪技术7.WGA-HRP-TMB-SNP 呈色反应1.实验动物分组取健康成年猫12只（体重3-3.5kg).随机分为4组，每组3只:正常对照组 双侧部分去背根术后左侧针刺组 双侧部分去背根术后左侧针刺加BDNF抗体封闭组 双侧部分去背根术后左侧针刺加N
6、T-3抗体封闭组2.动物模型制备实验动物用2%戊巴比妥钠（2ml/kg）腹腔注射麻醉后双侧备用根手术（即切除双侧L1-L5、L7-S2背根节，保留双侧L6为备用根）。对照组不做任何处理。3.穴位选择和针刺方法本研究仍沿用本室既往已选用的L6脊神经外周支配区内的两组穴位：足三里和悬钟，伏兔和三阴交。电针刺激于动物术后当日开始。以两根1寸毫针分别刺入一组中的两个穴位作为正负极电针，以频率98次/分针刺30分钟（15分钟时交换电极），每天针刺一组穴位，两组穴位交替进行，直至动物取材为止。左侧针刺。图二足三里，腓骨小头前下方1.5cm处的肌沟中；悬钟，外踝尖上1.5cm、近腓骨前缘处；伏兔，髂前上棘与
7、髌骨底外侧端连线的中下1/3交界处；三阴交，内踝尖上1.5cm胫骨内缘后方。4.4.实验所需仪器和试剂实验所需仪器和试剂4.1 仪器 37恒温箱 上海市跃进医疗器械一厂恒温水浴箱 黄骅市渤海电器厂恒冷冰冻切片机 Germany Leica CM900低温冰箱 Sanyo（-20，4）1000、100、10l可调微量加样枪 上海医用激光仪器厂电热蒸馏水器 北京市光明医疗器械厂微量进样器 上海高鸽工贸有限公司850-C型电针仪 广东省汕头市医用设备厂4.2 试 剂 BDNF抗体 Flinders University of South Australia NT-3抗体 WGA-HRP（2%结合态）
8、(Toyobo,Tokyo,Japan)TMB（四甲基联苯胺）T8768 Sigma分装 SNP（硝普钠）北京化工试剂厂产品 戊二醛溶液（含量25%）汕头市达濠精细化学品公司 免疫组化常规试剂：Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、NaCl、多聚甲醛、HCl、NaOH、蔗糖the Department of Human Physiology and 113 Centre for Neuroscience,主要试剂的配制：(1)0.1mol/L PB缓冲液：1)PB母液的配制：A液酸性：0.2M NaH2PO4H2O（分子量138.01）27.6g，溶解后倒入1000ml容量瓶中，加
9、单蒸水到终刻度；B液碱性：0.2M Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.6g，溶解后倒入1000ml容量瓶中，加双单蒸水到终刻度；2)0.2mol/L pH7.4的PB的配制：A液(0.2 mol/L NaH2PO4H2O)19mlB液(0.2 mol/L Na2HPO412H2O)81ml测pH值，加滴A液或B液调整至pH为7.4。3)0.1mol/L pH7.4的PB的配制：将0.2mol/L pH7.4的PB50 ml加入小烧杯中；再加入单蒸水使小烧杯中的溶液体积达90ml左右；测pH值，加滴A液或B液调整至pH为7.4；将溶液倒入容量瓶，加单蒸水定容至100ml，充分混
10、匀。(2)0.1mol/L pH7.3的PBS磷酸盐缓冲液：称取NaCl 9g置于1000ml大烧杯中；将0.2mol/L pH7.4的PB500 ml加入大烧杯中，搅拌，使NaCl完全溶解；再加入单蒸水使大烧杯中的溶液体积达900ml左右；测pH值，加滴A液或B液调整至pH为7.3；将溶液倒入容量瓶，加单蒸水定容至1000ml，充分混匀。(3)0.2 mol/L醋酸缓冲液100ml（pH3.3）醋酸钠3H2O 2.72g蒸馏水 81ml1.0NHCL 19ml注：测Ph值，用浓醋酸或氢氧化钠调pH至3.3(4)孵育液（包括A、B两液）A液：硝普钠 90-100mg蒸馏水 92.5ml醋酸缓冲
11、液 5mlB液：TMB 5mg无水酒精 2.5ml可加热致37使TMB溶解注：A、B两液临用现配，用时混合。(5)4%多聚甲醛-0.1%戊二醛-15%苦味酸磷酸盐缓冲液（pH7.3-7.4）称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500-700ml 0.1 mol/L PB，加热至60左右，持续搅拌，滴加少许1N NaOH使溶液清亮，加150ml饱和苦味酸，补足0.1 mol/L PB至1000ml，充分混均，调pH至7.3-7.4，4冰箱内保存，临灌注前，量取出4ml并置换入含量25%的戊二醛4ml。5体内抗体封闭：操作方法：操作方法：术中暴露出终池，置入一段硬膜外麻醉导管，进行抗体注射。注
12、射时间：注射时间：术中注射一次，以后隔天一次，共5次。注射剂量：注射剂量：100l（200g/ml）6.辣根过氧化物酶（HRP）示踪技术6.1 动物麻醉6.2 WGA-HRP的注入6.3 动物存活一定时间6.1动物麻醉常用麻醉剂为戊巴比妥钠。动物麻醉不宜过深，过深可抑制神经元的活动度，影响HRP在轴突内的运输速度，同时也易导致动物不苏醒或死亡。一般的原则是：勿过深，时间勿过长，最好在注射完毕时动物已苏醒。6.2 WGA-HRP的注入用1l微量进样器从背根节的中枢端进针至近背根节的周围端,即近椎间孔处。（图三）速度：影响WGA-HRP在组织内的扩散程度 注射过快，在局部形成的压力过大，易造成局部
13、组织损伤出血 过慢则使注射范围太局限 一般情况下，注射1l的时间为3-4min剂量：1l图三 HRP跨神经元追踪技术演示6.3 动物存活一定时间一般逆行和顺行的运输速度参考值为5080mm/d和50500mm/d。公式(估计存活期):即最佳存活期（日）=（束路长度mm/350mm）+1日。WGA-HRP在神经细胞内的降解速度较慢，存活时间稍长不致影响标记物的数量。7.WGA-HRP-TMB-SNP 呈色反应7.1 灌注，取材，切片灌注分为两部分：25mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）固定液，常用的固定液为4%多聚甲醛-0.1%戊二醛-15%饱和苦味酸 PB（pH 7.4），灌注速度先快后
14、慢，约3040min灌完取材及切片 各脊髓节段及两侧L6 DRG，入20%蔗糖PB液4过夜-20恒冷箱切片，片厚30或40m（每例每节段标本各间隔2张取一张切片）7.2 酶组织化学染色 按照Mesulam法做呈色反应(Mesulam.1982)。较常用的是TMB（四甲基联苯胺），也可用DAB（二氨基联苯胺）显色。切片蒸馏水洗，3次，每次2min。温的孵育液避光孵育20min，不断晃动。将切片取出，每100ml孵育液中加入0.3%的H2O2 1.05.0ml，混匀，孵育20min。洗片：醋酸洗液（4）漂洗，3次，每次5min。贴片，载玻片用铬矾明胶包被，室温空气干燥 脱水、透明 中性树胶封片 8
15、 统计学处理数据均采用均数标准差（MEANSEM）表示。应用SPSS12.0 For Windows统计软件包，组内比较用配对t检验，组间比较用单因素方差分析。凡P0.05，结果有统计学意义。四、预期研究成果四、预期研究成果&阐明部分去背根猫针刺和抗体封闭后备用背根节神经元的纤维联系及出芽，藉以进一步了解BDNF、NT-3与针刺促进脊髓可塑性的关系。五、已具备的实验条件五、已具备的实验条件1、模型制备、针刺、抗体封闭、追踪迹的注射及最终的酶组化技术本室已经成熟。本研究是以往工作的继续和深入，因此，前期的工作为完成本项目提供了必备的研究前提。2、本实验所需的仪器和设备我神经科学研究所基本可满足。
16、六、实验中可能遇到的问题六、实验中可能遇到的问题1、追踪剂WGA-HRP的注射技术2、追踪剂注射后动物存活期的问题。3、酶组化技术的稳定性。七、前期工作基础七、前期工作基础本研究课题拟采用酶组化技术研究针刺对部分切断背根猫备用背根节神经元的纤维联系及出芽，及神经营养因子在针刺中的作用。为临床上合理应用针刺及NTFs进行脊髓损伤修复提供理论依据该课题理论依据科学、充分，课题设计合理，研究内容紧跟国际神经科学研究前沿，研究方法切实可行，切实反映这一领域的国内外研究情况，也说明了拟采用的方法和具体技术路线。该课题可行性强，有一定的理论和实际应用价值，特别是将对针刺及NTFs用于临床上治疗脊髓损伤修复
17、提供有价值的科学依据八、实验的主要阶段、进度和完八、实验的主要阶段、进度和完成时间成时间2007.6 动物模型制备;2007.7-10 抗体封闭及电针刺;2007.11-12 追踪剂注射、灌注取材、酶组化;2008.1-3 实验结果的图象分析、统计学处理、撰写论文。九、经费预算九、经费预算d 预计经费需要6000元。参考文献1.Liu CN,Chambers WW.Intraspinal sprouting of dorsal root axon.Ach Neurol Psychia.1958;79:46-612.Goldberger ME,Murray M.Restitution of fu
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