1、SRY基因的检测基因的检测 目的要求目的要求掌握PCR反应的基本原理掌握性别决定的分子机制掌握用PCR扩增检测性别的方法掌握用PCR扩增检测性别方法的应用原理n1 1聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain polymerase chain reactionreaction，PCRPCR）的基本原理是，通过）的基本原理是，通过热变性使目的热变性使目的DNADNA（模板（模板DNADNA）双链解）双链解开；通过退火将引物复性结合到它们开；通过退火将引物复性结合到它们的互补位置；通过的互补位置；通过DNADNA聚合酶延长引物，聚合酶延长引物，反复循环体外扩增出大量一对引物之反复
2、循环体外扩增出大量一对引物之间的间的DNADNA片段。片段。n聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain Reaction（PCR）一种可以将目的微量的一种可以将目的微量的DNA片断扩增片断扩增100万倍以上的技术万倍以上的技术PCR 可以把 数量放大百万倍百万倍染色体Mullis(1993)PCR基本工作原理基本工作原理n以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3和5端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制延模板链延伸直至完成新的DNA合成。n重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。PCR体系基本组成成分体系基本组成成分l含含M
3、g2+的缓冲液的缓冲液ldNTPsl耐热耐热DNA聚合酶聚合酶lTag DNA聚合酶聚合酶l特异性引物特异性引物l一对分别与待扩增一对分别与待扩增DNA序列两端互序列两端互补的寡核苷酸片段。补的寡核苷酸片段。l模板模板DNAPCR基本反应步骤基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C循环循环25-30次次使模板使模板DNA完全变性成单链。完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除的局部双链得以消除使引物和模板使引物和模板DNA退火结合退火结合此温度下此温度下DNA聚合酶以聚合酶以dNTP 为底物催化为底物催化DNA链的延长链的延长三个
4、步骤为一个循环，三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环轮模板进入下一轮循环第一轮循环5/3/3/5/5/5/5/5/引物引物A引物引物B变性（变性（95）6075859590807065555045403530退火（退火（60）延伸（延伸（72）第二轮循环5/5/5/3/3/5/5/5/引物引物A引物引物B6075859590807065555045403530变性（变性（95）退火（退火（60）延伸（延伸（72）5/5/5/5/DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol第三次循环5/5/5/5/5/5/5/607585959080706
5、55550454035305/变性（变性（95）退火（退火（60）延伸（延伸（72）DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol基因组基因组DNADNA样品样品第一次循环第一次循环第二次循环第二次循环第三次循环第三次循环第四次循环第四次循环待扩增序列待扩增序列引物引物A引物引物B3/5/3/5/5/3/5/3/PCR的主要用途的主要用途PCR的的用途用途基因突变基因突变分析分析基因的基因的体外突变体外突变目的基因目的基因的克隆的克隆DNA序列测定序列测定DNA和和RNA的微量分析的微量分析1、与反转录结合，直接从组织细胞中的m
6、RNA 获得目的基因；2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段；3、利用简并引物从cDNA 文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。RNA需要反转录。利用PCR结合其它技术，可以提高基因突变检测的敏感性。原理n2 2 人类个体的表型性别是由人类个体的表型性别是由Y Y染色体决定染色体决定的的,具体地说是由具体地说是由Y Y染色体上编码睾丸发染
7、色体上编码睾丸发育的睾丸决定因子育的睾丸决定因子(testis determining(testis determining factor,TDF)factor,TDF)基因所决定，基因所决定，TDFTDF基因的存基因的存在决定着睾丸的发育，即决定个体发育在决定着睾丸的发育，即决定个体发育为男性。研究表明为男性。研究表明TDFTDF基因位于基因位于Y Y染色体染色体短臂与拟常染色体相接的短臂与拟常染色体相接的35kb35kb区域，该区域，该区域又称为区域又称为Y Y染色体性别决定区（染色体性别决定区（sex sex determining region of the Ydetermining
8、region of the Y，SRYSRY）。）。n3 3 在在SRYSRY基因区域设计特异的引物，如果基因区域设计特异的引物，如果能够利用能够利用PCRPCR技术体外扩增出技术体外扩增出SRYSRY基因片段，基因片段，即可判断为男性，否则为女性。本实验在即可判断为男性，否则为女性。本实验在SRYSRY基因区域内设计了一对引物，利用引基因区域内设计了一对引物，利用引物物Y Y1.51.5/Y/Y1.61.6扩增出一扩增出一239bp239bp的片段的片段。n4 4 利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增SRYSRY基因片段检测性别基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值，如结合细胞遗具有广泛的实
9、际应用价值，如结合细胞遗传学的核型分析，通过确认传学的核型分析，通过确认SRYSRY所在区域所在区域的缺失或易位，诊断的缺失或易位，诊断4646，XYXY女性或女性或4646，XXXX男性性反转综合征的患者；通过检测胎儿男性性反转综合征的患者；通过检测胎儿的性别，预防甲型血友病、的性别，预防甲型血友病、G6PDG6PD缺乏症等缺乏症等X X连锁隐性遗传病患儿的出生；连锁隐性遗传病患儿的出生；n5 5 通过骨髓移植后通过骨髓移植后Y Y染色体特异的染色体特异的SRYSRY基因片段的基因片段的DNADNA分析是由阳性转为阴性分析是由阳性转为阴性或相反，来判断异性别的骨髓移植程度；或相反，来判断异性
10、别的骨髓移植程度；多年尸块的多年尸块的DNADNA常有降解，而常有降解，而PCRPCR只分只分析析DNADNA的一小部分，不受降解的影响，的一小部分，不受降解的影响，因此本实验技术常应用于法医学上尸块因此本实验技术常应用于法医学上尸块或血斑的性别确定；此外，本实验还可或血斑的性别确定；此外，本实验还可用于需要快速、准确、同时需检查大量用于需要快速、准确、同时需检查大量标本的运动员体检。标本的运动员体检。n一、一、由微量外周血标本制备模板由微量外周血标本制备模板DNA 试剂与材料：试剂与材料：1、细胞裂解缓冲液细胞裂解缓冲液（SDSSDS；蛋白酶蛋白酶K K）2、酚：氯仿：异戊醇（、酚：氯仿：异
11、戊醇（25：24：1体积体积比）比）3、3mol醋酸钠（醋酸钠（PH5.2）4、无水乙醇，、无水乙醇，-20保存保存 5、70%乙醇，乙醇，-20保存保存 6 6、TETE缓冲液缓冲液 步骤n1、1.5ml Eppendorf离心管中加入细胞裂解液离心管中加入细胞裂解液100l。n2、取末梢血一滴（约取末梢血一滴（约5-10l）立即悬浮）立即悬浮细胞裂细胞裂解液中，解液中，37保温保温2小时。小时。n3、加入、加入100l酚：氯仿：异戊醇（酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体体积比）混合液，盖紧。轻轻摇混，充分混合；室积比）混合液，盖紧。轻轻摇混，充分混合；室温温15000rpm离心离心5分钟。
12、分钟。n4、用 开 口 粗 的 吸 管 转 移 上 层 水 相 于 新 的、用 开 口 粗 的 吸 管 转 移 上 层 水 相 于 新 的Eppendorf离心管离心管，按步骤，按步骤5重复抽提重复抽提1次。如次。如果水相还混浊，增加一次酚抽提。果水相还混浊，增加一次酚抽提。步骤n5、转移上层水相，加入、转移上层水相，加入10l 3mol醋酸钠醋酸钠（PH5.2）轻摇混匀，再加入）轻摇混匀，再加入250l冷无水乙醇冷无水乙醇沉淀沉淀DNA。室温放置。室温放置10分钟。分钟。n6、415000rpm离心离心15分钟，使分钟，使DNA沉淀（颗沉淀（颗粒化）。粒化）。n7、弃上清，加、弃上清，加70
13、%冷乙醇冷乙醇500l轻振混匀，轻振混匀，415000rpm离心离心5分钟。分钟。n8、弃上清，将、弃上清，将Ep管倒置在纸巾上，完全除去水管倒置在纸巾上，完全除去水分。将分。将DNA自然干燥。自然干燥。n9、加加10l TE溶解，制成溶解，制成DNA样品。（进行样品。（进行PCR时，取时，取1l即可）。即可）。n二、二、PCR检测性别检测性别n 试剂与材料：试剂与材料：n1、上、下游引物上、下游引物（各（各5 mol/L）n2、模板模板DNA溶液溶液n3、10PCR缓冲液：（高压灭菌）缓冲液：（高压灭菌）n4、dNTPs溶液（溶液（2.5mmol/L原液）原液）n5、Taq DNA聚合酶（聚
14、合酶（5U/l）n6、液体石蜡（高压灭菌）液体石蜡（高压灭菌）n琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段片段 n7、电泳级琼脂糖n8、电泳缓冲液：5TBE贮存液 n9、5mg/ml的溴化乙锭溶液，4暗存。n10、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油于水中。4贮存。n11、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶模和加样孔梳齿。n12、透射紫外灯、照相机和胶带纸。实验步骤：实验步骤：（一）、（一）、SRY基因引物设计基因引物设计 Y1.5 5-CTA GAC CGC AGA GGC GCC AT-3 Y1.6 5-TAG TAC CCA CGC CTG CTC CGG-3
15、扩增扩增DNADNA片段长度片段长度239bp239bp n（二）、二）、PCR反应反应 n1、在在0.5ml Eppendorf管中依次加入管中依次加入H2O 60.5l10PCR缓冲液缓冲液 10ldNTPs溶液（溶液（2.5mmol/L原液）原液）8l（0.2mmol/L）上游引物上游引物（5 mol/L）10l（0.5mol/L）下游引物下游引物（5 mol/L）10l（0.5mol/L）模板模板DNA溶液（基因组溶液（基因组DNA溶液）溶液）1l Taq DNA聚合酶（聚合酶（5U/l）0.5l（2.5U/100l）n 总量总量 100ln2、混匀，短暂离心。混匀，短暂离心。n3、P
16、CR条件条件Y1.5/Y1.6PCR扩增条件：扩增条件：变性变性 955分钟分钟 变性变性 9475秒秒 复性复性 5590秒秒 延伸延伸 72150秒秒循环循环30次。次。扩增产物冷却至室温可于扩增产物冷却至室温可于44保存。保存。（三）、扩增产物分析（方法（三）、扩增产物分析（方法参见实验四、琼脂参见实验四、琼脂糖凝胶电泳分离糖凝胶电泳分离DNA片段）片段）1、组装制胶模。组装制胶模。2、参照琼脂糖凝胶的分离能力表选择凝胶浓度参照琼脂糖凝胶的分离能力表选择凝胶浓度（一般为（一般为0.8%），称取琼脂糖，用电泳缓冲液），称取琼脂糖，用电泳缓冲液在沸水浴上或微波炉上将琼脂糖颗粒完全溶解。在沸水浴上或微波炉上将琼脂糖颗粒完全溶解。3、待胶冷却至待胶冷却至50左右，加入左右，加入溴化乙锭溴化乙锭（终浓度为（终浓度为0.5g/ml，每，每10ml加入加入1l原液原液），充分混匀后倒入胶模。），充分混匀后倒入胶模。4、向、向DNA酶解管中加入酶解管中加入1/10体积的上样体积的上样缓冲液，充分混合。用微量移液器将样缓冲液，充分混合。用微量移液器将样品依次加入加样孔内。品依次加入加样孔内。n5、电泳。电泳。n6、电泳完成后可直接在透射紫外灯下电泳完成后可直接在透射紫外灯下观察结果。观察结果。
