1、5/19/2023In-FusionIn-Fusion克隆技术介绍5/19/20232基因克隆背景简介基因克隆背景简介TA克隆克隆限制性酶切克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆平滑末端克隆缺点：连接效率低缺点：连接效率低 耗时较长耗时较长 需要特定限制性酶切位点需要特定限制性酶切位点5/19/20233In-Fusion克隆产品克隆产品Clontech专利专利In-Fusion HD Cloning System任意载体任意载体任意基因片段任意基因片段这是一款让您这是一款让您随心所欲随心所欲地实现基因定向克隆的产品！地实现基因定向克隆的产品！In-FusionIn-Fusion 基因克隆特点基因克隆
2、特点4 5/19/20235主要内容主要内容2In-Fusion优点及应用实例优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍系列产品介绍4常见问答常见问答1In-Fusion克隆技术的原理克隆技术的原理May 19,20236 主要内容主要内容2In-Fusion优点及应用实例优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍系列产品介绍4常见问答常见问答1In-Fusion克隆技术的原理克隆技术的原理In-FusionIn-Fusion 基因克隆技术原理示意图基因克隆技术原理示意图In-Fusion专利酶专利酶Clontech专利专利In-Fusion是一种是一种快速、简单、高效快速、简单、高效
3、的基因克隆技术！的基因克隆技术！50，15 min单管反应单管反应7 May 19,20238 主要内容主要内容2In-Fusion优点及应用实例优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍系列产品介绍4常见问答常见问答1In-Fusion克隆技术的原理克隆技术的原理5/19/20239In-FusionIn-Fusion 克隆技术的优点克隆技术的优点不附加任何多余序列不附加任何多余序列2不受限制性内切酶酶切位点的限制不受限制性内切酶酶切位点的限制3可同时克隆两个或多个可同时克隆两个或多个DNA片段片段 41简便、快速、高效的克隆技术简便、快速、高效的克隆技术5/19/202310简便、快速
4、、高效的克隆技术简便、快速、高效的克隆技术 快速！快速！5/19/202311In-Fusion HD无论是克隆无论是克隆长基因片段长基因片段还是克还是克隆隆多个基因片段多个基因片段都能保持较高的克隆效率。都能保持较高的克隆效率。高效！高效！简便、快速、高效的克隆技术简便、快速、高效的克隆技术5/19/202312不附加任何多余序列不附加任何多余序列线性化载体线性化载体任意载体任意载体克隆位点克隆位点目的目的DNA片段片段不需要的碱基序列不需要的碱基序列引物设计引物设计PCR扩增扩增与载体相同的与载体相同的15 个碱基个碱基 序列序列In-Fusion连接反应连接反应15 min 不附加任何多
5、余序列不附加任何多余序列的重组载体的重组载体无缝克隆：无缝克隆：不附加任何多余序列不附加任何多余序列ABC5/19/202313不受限制性内切酶酶切位点的限制不受限制性内切酶酶切位点的限制In-Fusion克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制:在在cDNA序列中插入序列中插入内含子内含子,荧光蛋白基因荧光蛋白基因 在在cDNA序列添加序列添加UTRs 转换纯化标签例如转换纯化标签例如Myc 转换为转换为His 缺失缺失蛋白表达区域蛋白表达区域表达载体表达载体选择插入位点选择插入位点PCR扩增扩增纯化纯化目的目的DNA片段片段混合混合In-FusionIn-Fus
6、ion引物设计引物设计PCR扩增扩增 重组载体重组载体5/19/202314可同时克隆两个或多个可同时克隆两个或多个DNADNA片段片段Step 2:目的目的DNA片段扩增片段扩增Step 3:一次一次In-Fusion连接反应连接反应Step 1:制备线性化载体制备线性化载体片段片段1片段片段2片段片段3线性化载体线性化载体重组载体重组载体5/19/202315克服传统克隆技术的限制克服传统克隆技术的限制克服其它克隆技术的限制其它克隆技术的限制In-Fusion解决方案载体的限制 不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体必须使用提供的载体只要载体末端和插入片段末端具有15个同源碱基，In-Fusi
7、on就可以将任意PCR片段插入任意线性化载体中。必须进行限制性内切酶酶切和连接需要独一无二、兼容的酶切位点极少的合适酶切位点In-Fusion不受限制性酶切位点的限制，因此在目的片段及使用的载体中是否存在合适的酶切位点并不妨碍克隆。亚克隆繁琐多片段不能同时克隆In-Fusion能够在一次反应中同时克隆多个片段，无需进行亚克隆。对于大片段克隆效率较低对于插入片段有限制In-Fusion系统能够高效克隆0.05-15 kb DNA片段。非定向克隆需要筛选目的片段插入方向 正确的克隆In-Fusion是基因定向克隆技术，因此无需进行目的基因片段正确插入的克隆的筛选。会附加多余碱基序列In-Fusio
8、n是无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。不适合中型和大规模克隆工程In-Fusion技术已经成功用于多项高通量克隆工程。5/19/202316In-FusionIn-Fusion 克隆技术的应用克隆技术的应用多片段克隆多片段克隆构建载体模型构建载体模型插入突变位点插入突变位点高通量克隆高通量克隆5/19/202317应用实例应用实例实例：多个实例：多个DNA片段（片段（1 kb,2 kb,3 kb)同时克隆同时克隆【方法方法】使用使用TaKaRa高品质高品质PCR酶分别扩增酶分别扩增1 kb、2 kb、3 kb的目的的目的DNA片段片段 和和2.7 kb的载体，并将扩增产物混合，使用的载体，并将
9、扩增产物混合，使用In-Fusion HD试剂盒完成试剂盒完成 克隆。利用高效率的感受态细胞克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTM Competent Cells（产品编（产品编 号：号：636763）转化并进行蓝）转化并进行蓝/白斑筛选。白斑筛选。5/19/202318引物设计及目的基因片段扩增引物设计及目的基因片段扩增引物的引物的5末端必须包含与末端必须包含与载体末端相同载体末端相同的的15个碱基序列个碱基序列引物的引物的3末端必须包含与末端必须包含与目的基因片段相互补目的基因片段相互补的特异碱基序列的特异碱基序列5/19/202319载体线性化载体线性化PCR扩增扩增酶切处理酶切
10、处理5/19/202320In-FusionIn-Fusion连接反应连接反应In-Fusion专利酶专利酶线性化载体线性化载体目的基因片段目的基因片段反应液反应液直接转化直接转化In-Fusion连接反应连接反应50 15 min【结果结果】Cloning Enhancer处理，处理，37 15 min，80 15 min 引物设计原则引物设计原则引物的引物的5末端必须包含与末端必须包含与载体末端相同载体末端相同的的15个碱基序列个碱基序列引物的引物的3末端必须包含与末端必须包含与目的基因片段相互补目的基因片段相互补的特异碱基序列的特异碱基序列May 19,202321 引物设计原则引物设计
11、原则May 19,202322 5/19/202323引物设计网络工具引物设计网络工具在线支持工具在线支持工具May 19,202324 主要内容主要内容2In-Fusion优点及应用实例优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍系列产品介绍4常见问答常见问答1In-Fusion克隆技术的原理克隆技术的原理5/19/202325产品列表产品列表5/19/202326基础款相关产品基础款相关产品5X In-Fusion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector,linearized(50 ng/l)2 kb Control Insert(40 ng/l)In
12、-Fusion HD Cloning Kit（639648/49/50)组分组分5/19/202327附带附带Cloning Enhancer的相关产品的相关产品Cloning Enhancer的作用的作用：消除消除PCR反应液中的引物二聚体和反应液中的引物二聚体和dNTP等的影响等的影响无需对无需对PCR产物进行胶纯化产物进行胶纯化操作简单操作简单In-Fusion HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer(639633/34/35)5/19/202328Up to 5X Higher Efficiency未经处理未经处理Cloning Enhancer处理处理Cl
13、oning Enhancer的实用例的实用例May 19,202329 主要内容主要内容2In-Fusion优点及应用实例优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍系列产品介绍4常见问答常见问答1In-Fusion克隆技术的原理克隆技术的原理5/19/202330In-Fusion Kit In-Fusion Kit 常见问答常见问答Q1.如何选择如何选择PCR酶？酶？A1.可以可以使用任何使用任何PCR酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我们推荐使用高保真的们推荐使用高保真的PCR酶。酶。Q2.载体和插入的载体和插入的DNA片段末端结构有限制
14、吗？片段末端结构有限制吗？A2.没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无A尾均可尾均可 进行有效的连接反应。进行有效的连接反应。Q3.载体和插入的载体和插入的DNA片段的长度有限制吗？片段的长度有限制吗？A3.没有特别的限制。载体和插入的没有特别的限制。载体和插入的DNA片段即使超过片段即使超过10 kb也可以进也可以进 行连接反应，只是连接效率会有所降低。插入的行连接反应，只是连接效率会有所降低。插入的DNA片段只要不少片段只要不少 于于50 bp就可进行有效的连接反应。就可进行有效的连接反应。Q4.线性化载体末端是否需要进行去磷酸化处理？线性化载体末端是否需要进行去磷酸化处理？A4.线性化载体末端磷酸基团的存在与否不会影响线性化载体末端磷酸基团的存在与否不会影响In-Fusion连接效率。连接效率。因此，不需要对线性化载体进行去磷酸化处理。因此，不需要对线性化载体进行去磷酸化处理。5/19/202331技术支持技术支持：800-810-6261；/86：我们将竭诚为您服务！我们将竭诚为您服务！
