1、PCRPCR技术及临床应用、新冠病毒核技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理酸检测原理 授课人：刘翔宇授课人：刘翔宇目目 录录一一核酸基本知识核酸基本知识二二PCRPCR的发展史的发展史三三PCRPCR技术简介技术简介四四实时实时荧光荧光PCRPCR技术技术五五实时实时荧光荧光PCRPCR的临床应用的临床应用六六新冠病毒核酸检测原理新冠病毒核酸检测原理一、核酸基本知识一、核酸基本知识核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标志核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标志 核酸的分类：脱氧核糖核酸（核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNADNA），核糖核酸（），核糖核酸（RNARNA）。）
2、。DNADNA和和RNARNA的区别在于：的区别在于：DNADNA所含的戊糖为脱氧核糖，而所含的戊糖为脱氧核糖，而RNARNA所含的所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，戊糖为核糖；在碱基成分中，DNADNA含胸腺嘧啶含胸腺嘧啶T T，而，而RNARNA含脲嘧含脲嘧啶啶U U。核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。核酸
3、的基本结构核酸的基本结构遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则DNADNA的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补配的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补配对的原则进行半保留复制。对的原则进行半保留复制。聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCRPolymerase Chain Reaction,PCR）是一种用于放大扩增特定的是一种用于放大扩增特定的DNADNA片段的分子生物学技片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊术，它可看作是生物体外的特殊DNADNA复制，复制，PCRPCR的最大的最大特点是能将微量的特点是能将微量的DNA
4、DNA大幅增加。大幅增加。二、二、PCRPCR的发展史的发展史19531953年，沃森和克里克发现了年，沃森和克里克发现了DNADNA双螺旋的结构，开双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学,分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。19851985年美国年美国PE-CetusPE-Cetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的Mullis Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。19881988年初，年初，Keohanog
5、Keohanog改用改用T4 DNAT4 DNA聚合酶进行聚合酶进行PCRPCR，其，其扩增的扩增的DNADNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种的一种DNADNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。片段。但每循环一次，仍需加入新酶。19881988年年Saiki Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)(thermus aquaticus)中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNADNA聚合聚合酶，此酶的发现使酶，此酶的发现使PCRPCR广泛的被应用。广泛的被应用。实时荧光定量实时
6、荧光定量PCRPCR技术于技术于19961996年由美国年由美国Applied Applied BiosystemsBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了公司推出，由于该技术不仅实现了PCRPCR从定性到定量的飞跃，而且与常规从定性到定量的飞跃，而且与常规PCRPCR相比，它具相比，它具有特异性更强、有特异性更强、PCRPCR污染少、自动化程度高等特点，污染少、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。目前已得到广泛应用。第一代：手动第一代：手动/机械手式水浴基因扩增机械手式水浴基因扩增用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个
7、温度：PCRPCR的高温变性温度（如的高温变性温度（如9494）低温复性温度（如）低温复性温度（如5858），适温延伸），适温延伸温度（如温度（如7272）。再用一个装有）。再用一个装有PCRPCR标本试管的提篮，用手工在标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴。不同温度的水浴箱中依次水浴。这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想须升降温过程，实验时间短，试验更
8、接近理想PCRPCR反应条件反应条件。第二代：自动化控制型第二代：自动化控制型PCRPCR 使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电泳的方式对泳的方式对PCRPCR产物进行分析，但存在着操作产物进行分析，但存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等不足。且无法对起始模板准确定量，无法等不足。且无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。对扩增反应实时检测。第三代第三代PCRPCR：实时荧光定量：实时荧光定量PCRPCR为了避免上述传统为了避免上述传统PCRPCR的缺陷，并对基因的表达的缺陷，并对基因的表达水平进行定量
9、分析，水平进行定量分析，19921992年诞生了所谓年诞生了所谓“第三第三代代PCRPCR的荧光定量实时的荧光定量实时PCRPCR。所谓所谓real-time Q-PCRreal-time Q-PCR技术，是指在技术，是指在PCRPCR反应体反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个测整个PCRPCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。进行定量分析的方法。第四代第四代PCRPCR：数字：数字PCRPCR由于定量由于定量PCRPCR的分析最终结果依赖于的分析最终结果依赖于CtCt值，在这个意义上所谓
10、的值，在这个意义上所谓的“定定量量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“数字数字 PCRPCR应运而生。应运而生。数字数字PCRPCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCRPCR，数，数字字PCRPCR可让你能够直接数出可让你能够直接数出DNADNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。分子的个数，是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠因此特别适用于
11、依靠CtCt值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、果验证、miRNAmiRNA表达分析、单细胞基因表达分析等表达分析、单细胞基因表达分析等。三、三、PCRPCR技术简介技术简介 高温可以使双链高温可以使双链DNADNA解链成为单链，这一过解链成为单链，这一过程称为变性。程称为变性。变性后的变性后的DNADNA通过降温可以重新接合为双链，通过降温可以重新接合为双链，这一过程称为复性。这一过程称为复性。PCRPCR技术的基本原理类
12、似于技术的基本原理类似于DNADNA的天然复制过的天然复制过程，它的特异性取决于与靶序列两端互补的程，它的特异性取决于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物。利用温度的升降来控制利用温度的升降来控制DNADNA的变性和复性。的变性和复性。设计引物作为启动序列，加入设计引物作为启动序列，加入DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP（三磷酸脱氧核甘酸）等原料完成特（三磷酸脱氧核甘酸）等原料完成特定基因的体外复制。定基因的体外复制。周而复始的升降温度进行扩增，每一循环周而复始的升降温度进行扩增，每一循环可以使靶序列增加一倍。可以使靶序列增加一倍。PCRPCR扩增扩增步骤步骤DNADNA变性
13、（变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板在热作用下，氢模板在热作用下，氢键断裂，形成单链键断裂，形成单链DNADNA。退火（退火（25-6525-65）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNADNA模板结模板结合，形成局部双链。合，形成局部双链。延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，以酶的作用下，以dNTPdNTP（三磷（三磷酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的55端端33端延伸，合端延伸，合成与模板互补的成与模板互补的DNADNA链。每一循环经过变性、退火和延链。每一循环经过变性、退火和延伸，伸，DNADN
14、A的含量既增加一倍。的含量既增加一倍。PCRPCR扩增示意图扩增示意图3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.Amplicon Cycles Copies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824常用的技术常用的技术定性定性l电泳检测、放射自显影电泳检测、放射自显影l特异性差、易污染、只能定性特异性差、易污染、只能定性l特异性较好，极易污染、定量不准确特异性较好，极易污染、定量不准确终点法荧光终点法荧光l特异性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好特异性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好实时
15、荧光实时荧光l特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好四、四、实时实时荧光荧光PCRPCR技术技术实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR：在：在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个积累实时监测整个PCRPCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。分析的方法。定量定量PCRPCR仪是在普通仪是在普通PCRPCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，装置，PCRPCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电
16、泳检测，所以扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。有效地避免了样品间的交叉污染。荧光荧光PCRPCR的原理的原理实时实时荧光荧光PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念扩增曲线：反映扩增曲线：反映PCRPCR循环次数和荧光强度的曲线，定量循环次数和荧光强度的曲线，定量PCRPCR仪每次仪每次PCRPCR扩扩增都会自动记录荧光强度的变化增都会自动记录荧光强度的变化荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，仪器可自动计算，手动设置的原则要信号指数扩增阶
17、段任意位置上，仪器可自动计算，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.990.99。CtCt值：值：PCR PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。过的扩增循环次数。实时实时荧光荧光PCRPCR扩增曲线示意图扩增曲线示意图手工调整荧光阈值示意图手工调整荧光阈值示意图 CtCt值的意义值的意义CtCt值与重复性值与重复性同一样本在相同条
18、件下同时进行同一样本在相同条件下同时进行9696次次扩增扩增CtCt值与浓度值与浓度不同浓度的模板达到荧光域值时不同浓度的模板达到荧光域值时的的CtCt值不同值不同PCRPCR扩增的理论模式扩增的理论模式Yn=XYn=X*(1+E)(1+E)n n ，0E10E1，E E为扩增效率为扩增效率,X,X为原为原始模板数始模板数,Y,Y为为PCRPCR产物的分子数量产物的分子数量,n,n为周期数。为周期数。模板模板DNADNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，量越多，荧光达到域值的循环数越少，即即CtCt值越小。值越小。LogLog浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷浓度与循环数呈线性关系，通过已
19、知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品CtCt值，值，就可以计算出样品中所含的模板量。就可以计算出样品中所含的模板量。标准曲线的建立标准曲线的建立 梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接
20、影响着样品中目的基因曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因原始模板量的准确性。原始模板量的准确性。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术的特点技术的特点灵敏度高灵敏度高特异性强特异性强快速简便快速简便应用范围广应用范围广五、五、实时荧光实时荧光PCRPCR的临床应用的临床应用感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断肿瘤的诊断 法医学鉴定法医学鉴定早期诊断早期诊断 病情评估和预后判断病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证新药验证感染性疾病的诊断感染性疾病的
21、诊断 1.1.病原体含量与病情之间的关系病原体含量与病情之间的关系 2.2.病原体含量与用药之间的关系病原体含量与用药之间的关系 3.3.药物及疗法的研究与开发药物及疗法的研究与开发 4.4.新的病原体分子诊断标准新的病原体分子诊断标准 5.5.新的愈后指标新的愈后指标 6.6.传染病发病的监控、预测与预防传染病发病的监控、预测与预防六、六、新冠病毒核酸检测原理新冠病毒核酸检测原理 对新型冠状病毒（对新型冠状病毒（2019-nCoV2019-nCoV）ORF 1ab ORF 1ab 及编码核衣壳蛋白及编码核衣壳蛋白 N N 或或E E基因的特异性保守序列为靶区域，基因的特异性保守序列为靶区域，进行了双靶标基因的设计，进行了双靶标基因的设计，配以配以PCR PCR 反应液，反应液，在荧光定量在荧光定量 PCR PCR 仪上，仪上，应用实时荧光定量应用实时荧光定量 RT-RT-PCR PCR 检测技术，检测技术，通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒RNA RNA 的的检测。检测。
