1、RNA干扰技术基本原理与应用干扰技术基本原理与应用1ppt课件什么是什么是RNA干扰干扰 RNA干扰干扰(RNA interference，RNAi),又又称转录后基因沉默称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指将特异性同，是指将特异性同源双链源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降基因的不表达或表达水平下降.2001、2002年连续被年连续被Science评为年度十大成就评为年度十大成就!2ppt课件目前应用的基因干扰技术目前应用的基因干扰技术lDNA水平的基因干扰技术水平的
2、基因干扰技术F基因敲除技术基因敲除技术F寡核苷酸与双链寡核苷酸与双链DNA 杂交杂交F采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子3ppt课件目前应用的基因干扰技术目前应用的基因干扰技术lmRNA水平的基因干扰技术水平的基因干扰技术F用反义用反义RNA 技术阻遏翻译过程技术阻遏翻译过程,破坏内源性破坏内源性mRNAF设计寡核苷酸来破坏与设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白质结合的蛋白质,使使mRNA 不稳定不稳定F双链双链RNA 干扰技术（干扰技术（RNAi）4ppt课件RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程l1984 年年,Jonathan 研究小鼠研究
3、小鼠L 细胞时发现反义细胞时发现反义mRNA 会干扰同源基因的表达，机制不清会干扰同源基因的表达，机制不清l1990年年 Jorgensen等等 矮牵牛颜色加深实验矮牵牛颜色加深实验 “共抑制共抑制(co-suppresion)”5ppt课件RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程l1995年年 Su Guo 和和Ken Emphues 反义反义RNA阻断秀丽小杆线虫阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达基因的表达 实验实验 首次发现首次发现 RNA干扰现象干扰现象l1998年年 Andrew Fire和和Craig Mello 发现单链发现单链RNA抑制作用较弱，而纯化的抑制作用较弱，而纯化的
4、dsRNA可可高效、特异地抑制基因的表达高效、特异地抑制基因的表达 Nature1998；391:806-11 正式提出正式提出RNA干扰的概念干扰的概念6ppt课件RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程l1999年年 Tuschl等等 报道在哺乳动物中也存在报道在哺乳动物中也存在RNAil2001 年年 Berstein 等等 提出只有提出只有22 核苷酸核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效才有特异性的阻断效应，并发现体内分解应，并发现体内分解dsRNA 为为siRNAs(short/small interfering RNA)的的DICER 酶酶7ppt课件RNAi的发现和发展历程的发现和
5、发展历程l2002 年年 Novina 等等 用用RNAi 技术实现了对技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑病毒的阻抑l2004年年 Morris 等等 用用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制技术实现了对人细胞基因的抑制 Science 2004(August 27)；305：1289-12928ppt课件RNAi的主要特点和优势的主要特点和优势l诱导转录后水平的基因沉默诱导转录后水平的基因沉默l具有高度的特异性具有高度的特异性l抑制基因表达的效率非常高抑制基因表达的效率非常高l可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去 “基因沉默系统化基因沉默系统化”9ppt课
6、件siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶l共同点共同点F 特异性特异性F 靶向性靶向性10ppt课件siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶l不同点不同点F独特的双链结构独特的双链结构F需要需要Dicer、RdRp、解旋酶、激酶等协同因子、解旋酶、激酶等协同因子FsiRNA 本身无催化活性本身无催化活性F在细胞内可能具有相对的稳定性在细胞内可能具有相对的稳定性F具有一定的可遗传性具有一定的可遗传性11ppt课件RNAi的主要过程的主要过程l启动阶段启动阶段 dsRNA(500nt左右最佳左右最佳)被被Dicer 酶酶特异性识特异
7、性识别，以一种别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成依赖的方式逐步切割成siRNA 长度：长度：21-25nt 结构：结构：3端悬垂两个未配对的碱基端悬垂两个未配对的碱基UU12ppt课件细胞中内源性细胞中内源性dsRNA的形成的形成l基因组中基因组中DNA 反向重复序列的转录产物反向重复序列的转录产物l同时转录反义和正义同时转录反义和正义RNA l病毒病毒RNA 复制中间体复制中间体l以单链以单链RNA 为模板由细胞或病毒的为模板由细胞或病毒的RNA 依赖依赖RNA 聚合酶聚合酶(RdRp)催化合成催化合成dsRNA13ppt课件Dicer酶酶lRNAase III超家族成员。超家族成员。结构
8、中包括一个螺旋结构中包括一个螺旋酶结构域，两个酶结构域，两个RNA酶酶结构域，一个双链结构域，一个双链RNA结合位点结合位点l对单链对单链RNA没有活性没有活性l对对200500nt的的dsRNA作用效果最好，能降作用效果最好，能降解成解成25nt左右的左右的siRNAl广泛存在广泛存在14ppt课件RdRp（RNA dependent RNA polymerase）l使异常的使异常的RNARNA转变为转变为dsRNAdsRNAl参与细胞内参与细胞内dsRNA和和siRNA的扩增的扩增lsiRNA与靶与靶mRNA 的结合可激活的结合可激活RdRp，形成，形成大量的大量的dsRNA15ppt课件
9、RNAi的主要过程的主要过程l效应阶段效应阶段FRNA诱导沉默复合体（诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）的形成的形成 siRNA、核酸内切酶、外切酶和解旋酶、核酸内切酶、外切酶和解旋酶FRISC的激活：的激活：ATP依赖的解双链过程依赖的解双链过程F在在siRNA反义链的指导下，反义链的指导下，RISC特异性切特异性切 割、割、降解靶降解靶mRNA，导致基因表达失活，导致基因表达失活 16ppt课件17ppt课件RNAi技术的实验方法技术的实验方法lsiRNA的设计原则的设计原则F序列大小序列大小 19-21nt，最好以，最好以A或或G开始开
10、始F从从mRNA的的AUG开始，寻找开始，寻找AA二连序列，二连序列，作为潜在的作为潜在的RNAi靶位点靶位点F不要针对不要针对5和和3端非编码区（端非编码区（untranslated regions，UTRs)18ppt课件RNAi技术的实验方法技术的实验方法lsiRNA的设计原则的设计原则F设计设计24个序列个序列,BLAST 比对基因序列以确比对基因序列以确保序列设计的特异性保序列设计的特异性F优先选择优先选择 GC 含量含量30-50%的序列的序列F设计适当的阴性对照序列设计适当的阴性对照序列19ppt课件阴性对照序列的设计阴性对照序列的设计l特异性特异性siRNA中的碱基进行随机排列
11、，且行中的碱基进行随机排列，且行BLAST基因比对基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCGl在特异性在特异性siRNA引入引入12个错配碱基个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG20ppt课件目标序列筛选的相关网站目标序列筛选的相关网站http:/www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp:/sfold.wadsworth.org/sirna.plhttp:/ 21ppt课件查找已经证实的查找已经证实的siRNA的网站的网站lhttp:/ 22p
12、pt课件siRNA的制备方法的制备方法l体外制备方法体外制备方法F化学合成化学合成siRNAF体外转录获取体外转录获取siRNAF利用利用Dicer或或 RNase消化长的消化长的dsRNA成成siRNA23ppt课件化学合成法制备化学合成法制备siRNAl优点：优点：纯度高纯度高 合成量不受限合成量不受限 能被标记能被标记l缺点：缺点：价格昂贵、合成周期长价格昂贵、合成周期长l用途：用途：已经找到最有效的已经找到最有效的siRNA的情况下，的情况下，需要大量需要大量siRNA进行研究进行研究 24ppt课件体外转录法制备体外转录法制备siRNAl优点：优点：简单简单 成本低成本低 速度快速度
13、快 毒性小毒性小 稳定性好稳定性好 l缺点：缺点：反应规模和量始终有一定的限制反应规模和量始终有一定的限制l用途：用途：筛选筛选siRNAs，特别是需要制备多种，特别是需要制备多种 siRNAs 25ppt课件26ppt课件消化法（消化法（“siRNAs 鸡尾酒鸡尾酒”）l优点：优点：无需检测或筛选多个无需检测或筛选多个siRNA序列序列 产生多种产生多种 siRNAs 混合体，保证有效的混合体，保证有效的 目的基因沉默目的基因沉默l缺点：缺点：有可能引发非特异的基因沉默有可能引发非特异的基因沉默 l用途：用途：快速而经济地研究某个基因功能缺失快速而经济地研究某个基因功能缺失 的表型的表型 2
14、7ppt课件28ppt课件siRNA的制备方法的制备方法l细胞内制备方法细胞内制备方法F依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNAF通过通过PCR介导的介导的siRNA表达试剂盒获取表达试剂盒获取siRNA29ppt课件siRNA载体载体l依赖依赖RNA聚聚合合酶酶III 启动子启动子(pol III)，操纵操纵一一段段小的小的发夹发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。在哺乳动物细胞中的表达。人源人源U6启启动子动子 鼠鼠源的源的U6启启动子动子 人人H1启启动子动子lpol III可可在细胞中表达许多的小分子在细胞中表达许多的小分子R RNA，通，通过过添
15、加添加一一串串（36个）个）U来来终终止转录的止转录的l需要订购需要订购2段编码短发夹段编码短发夹RNA序列的序列的DNA单链单链再克隆到载体中再克隆到载体中 30ppt课件表达载体法制备表达载体法制备siRNAl优点：优点：可以进行较长期研究。载体可以在细胞中可以进行较长期研究。载体可以在细胞中 持续抑制靶基因达数星期或更久持续抑制靶基因达数星期或更久l缺点：缺点：需要进行克隆，周期长需要进行克隆，周期长 质粒载体表达效率较低质粒载体表达效率较低l用途：用途：唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法31ppt课件32ppt课件基于基于PCR的的siRNA表达框架表
16、达框架(SECs)l组成：组成：RNA pol III启动子启动子 发夹结构发夹结构siRNA RNA pol III终止位点终止位点l制备：制备：PCR，无需克隆和测序，无需克隆和测序33ppt课件用用SECs制备制备siRNAl优点优点：F可直接由可直接由PCR得到，方法简便，时间短得到，方法简便，时间短F在在PCR片段两端添加酶切位点，筛选出片段两端添加酶切位点，筛选出 最有效最有效的的siRNA可用于构建表达载体可用于构建表达载体F可以用来筛选特定研究体系中启动子和可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNA的最适搭配的最适搭配 34ppt课件用表达框架制备用表达框架制备siRNAl缺
17、点缺点：FPCR产物很难转染到细胞中产物很难转染到细胞中F不能进行序列测定，不能进行序列测定，PCR和和DNA合成时可能合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想产生的误读不能被发现导致结果不理想 l用途用途：F筛选筛选siRNA序列序列F在将在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子克隆到载体前筛选最佳启动子 35ppt课件36ppt课件37ppt课件38ppt课件shRNA(short hairpin RNA)文库文库l Nature 2004；428：427-431(25 March)针对：针对：9,610 human genes 5,563 mouse genes 构建成：构建成：28
18、,000个个shRNA表达盒表达盒(cassettes)l商品化试剂盒：商品化试剂盒：Expression Arrest(美国冷泉港实验室美国冷泉港实验室 Open Biosystems公司公司)网上数据库中选择特定的网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需再耗时克隆，无需再耗时耗力进行耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程的设计、合成和验证过程39ppt课件CAM:氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 hr：同源重组位点：同源重组位点Barcode：每个每个shRNA独特的识别序列独特的识别序列 MSCV：病毒载体骨架：病毒载体骨架 PKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择：哺乳动物细胞
19、中载体稳定性的选择Kan、oriT、RK6：逆转录病毒信号序列：逆转录病毒信号序列40ppt课件siRNAshRNA使用代价使用代价高高相对较低相对较低持久性持久性最多最多2周周可选择获得稳定整合的细胞可选择获得稳定整合的细胞宿主类型宿主类型细胞系细胞系原代细胞，胚胎干细胞、细原代细胞，胚胎干细胞、细胞系胞系设计设计复杂的设计方法复杂的设计方法完成完成获取获取需要合成需要合成完成完成应用应用瞬时转染瞬时转染瞬时转染、稳定转染、病毒瞬时转染、稳定转染、病毒侵染侵染检测方法检测方法Western杂交、表型分杂交、表型分析析RT-PCR、芯片检测、芯片检测Western杂交、表型分析、杂交、表型分析
20、、RT-PCR、芯片检测、芯片检测研究领域研究领域细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养&体内研究体内研究41ppt课件42ppt课件43ppt课件44ppt课件siRNA转染细胞转染细胞 l.磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀 l电穿孔法电穿孔法 lDEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene l机械法机械法：显微注射和基因枪：显微注射和基因枪 l阳离子脂质体试剂阳离子脂质体试剂 45ppt课件提高转染效率的方法提高转染效率的方法l纯化的纯化的siRNAl避免使用抗生素避免使用抗生素l避免避免RNA酶污染酶污染 l较低传代数的细胞较低传代数的细胞 l合适的转染试剂合适的转染试剂 l合适的阳性对照合适的阳性对
21、照l荧光标记的荧光标记的siRNA 46ppt课件RNAi技术的应用技术的应用l基因组功能研究的新方法基因组功能研究的新方法l研究信号传导通路的新途径研究信号传导通路的新途径 l开展基因治疗的新策略开展基因治疗的新策略（抗病毒、（抗病毒、抗肿瘤等抗肿瘤等）l筛选药物靶点的新工具筛选药物靶点的新工具47ppt课件RNAi技术抗病毒技术抗病毒l作用作用F阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录F自然界中普遍存在自然界中普遍存在l在医学上的应用在医学上的应用FRNA病毒：如病毒：如HIV、HCV、脊髓灰质炎病毒、脊髓灰质炎病毒FDNA病毒：如病毒：如HBV48ppt课件R
22、NAi技术阻止技术阻止HIV的入侵的入侵lNovinaNovina将针对将针对CD4的的dsRNA导入导入 能表达能表达CD4、CCR 5、CXCR4的的M agi2CCR 5 细胞系），细胞系），能能使细胞表面使细胞表面CD4 表达减少表达减少75%；转染后；转染后60 小时小时后后,再用再用H IV 感染感染,结果发现结果发现CD4-siRNA 转染的转染的细胞很少有包涵体出现细胞很少有包涵体出现l其它试验的受体：其它试验的受体：CCR 5、CXCR449ppt课件RNAi技术抑制技术抑制HIV的复制的复制l将将HIV-1HIV-1编码编码revrev的基因和同源的的基因和同源的dsdsR
23、NARNA共转染共转染到到293293细胞中，细胞中，revrev基因的表达被显著抑制基因的表达被显著抑制lsiRNAsiRNA抑制抑制HIV rev-EGFPHIV rev-EGFP的表达，其抑制率可的表达，其抑制率可达到达到9090；而反义；而反义RNARNA，核酶组与对照组无显，核酶组与对照组无显著差异著差异50ppt课件NS5B-6133siRNANS3-1948siRNAGAPDHsiRNA+HCV表达质粒表达质粒Huh-7 细胞细胞共转染共转染HCV RNA 21倍倍HCV RNA 23倍倍HCV RNA 无变化无变化RNAi技术抑制技术抑制HCV的复制的复制51ppt课件52ppt课件RNAi技术抑制技术抑制HBV的复制的复制lHBVHBV是是DNADNA病毒，但是其复制过程需经过逆转录病毒，但是其复制过程需经过逆转录的过程。的过程。l针对针对HBVHBV的的S S，C C，X X，P P基因序列及基因序列及DR1DR1，DR2DR2等等调控元件序列，设计的调控元件序列，设计的siRNAsiRNA可显著抑制可显著抑制HBVHBV的的复制和蛋白表达复制和蛋白表达53ppt课件
