1、1实验模式动物实验模式动物斑马鱼斑马鱼生药学生药学 张彩张彩Use Zebrafish AS A Model Organism无忧PPT整理发布2汇报内容汇报内容斑马鱼概况斑马鱼概况斑马鱼作为模式生物的优点斑马鱼作为模式生物的优点斑马鱼在药物的评价中的应用斑马鱼在药物的评价中的应用采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒性采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒性无忧PPT整理发布3概概 况况70年代早期，斑马鱼仅在一个研究中心被详细研究：在位于年代早期，斑马鱼仅在一个研究中心被详细研究：在位于Eugene 的的 俄勒冈大学，俄勒冈大学，Charles Kimmel 及其同事开始将斑马鱼作
2、为研究发及其同事开始将斑马鱼作为研究发育的动物模型，并探索其作用育的动物模型，并探索其作用。第一部分Chuck Kimmel无忧PPT整理发布4斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注Turn Eyes to FishChristiane Nsslein-Volhard 1995 诺贝尔奖获得者诺贝尔奖获得者was able to identify and classify a small number of genes that are of key importance in determining the body plan and the formation of
3、body segments,turned eyes to fish and find a wide range of mutationsWolfgang Driever无忧PPT整理发布5斑马鱼基本特性斑马鱼基本特性产于热带印度，孟加拉国。产于热带印度，孟加拉国。成鱼体长成鱼体长46厘米。体呈纺锤形。雌雄易区分。厘米。体呈纺锤形。雌雄易区分。性情温和，对水温水质要求不高，易饲养。性情温和，对水温水质要求不高，易饲养。属卵生鱼类属卵生鱼类，4月龄进入性成熟期。繁殖期约月龄进入性成熟期。繁殖期约7天左右。产卵量高，天左右。产卵量高，繁殖力很强繁殖力很强。体外受精，胚胎透明，在体外受精，胚胎透明，在
4、2424小时内就可发育成形小时内就可发育成形，23天孵天孵出仔鱼出仔鱼 。6斑马鱼的繁殖7斑马鱼胚胎早期发育图谱无忧PPT整理发布8斑马鱼作为模式生物的优点斑马鱼作为模式生物的优点 1.斑马鱼基因与人类基因的相似度达到斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。此它受到生物学家的重视。2.斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响。其体内器官的影响。3.此外，雌性斑
5、马鱼可产卵数百枚，胚胎在此外，雌性斑马鱼可产卵数百枚，胚胎在24小时内就可发育小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。，进而研究病理演化过程并找到病因。无忧PPT整理发布9心血管系统发育心血管系统发育Development of Zebrafish Vascular System Nature Medicine,199510 Development of Zebrafish Vascular System28 hours 1.5 days 2 days 2.5 days 3 days
6、 3.5 days 4.5 days 5 days 6 days 7 days 无忧PPT整理发布11斑马鱼的骨骼发育斑马鱼的骨骼发育缺少chordin表达的斑马鱼的BMP蛋白水平异常，鳍和尾部骨架也异常注射chordin mRNA后可恢复。因此研究者使用斑马鱼的这项特性来进行基因筛查，以确定脊椎动物骨骼形成的调节机制。Rik DerynckNature Genetics,1999无忧PPT整理发布12斑马鱼的心脏再生斑马鱼的心脏再生 Heart Regeneration in Zebrafish斑马鱼的斑马鱼的Mps1 mitotic checkpoint kinase是是 一个至关重要的细
7、胞周期调节因子，如发生突变，则斑马鱼的心脏不一个至关重要的细胞周期调节因子，如发生突变，则斑马鱼的心脏不能被修复而形成疤痕。因此，损伤诱导的斑马鱼心肌细胞增殖可以克能被修复而形成疤痕。因此，损伤诱导的斑马鱼心肌细胞增殖可以克服疤痕形成，使心肌再生。这个发现表明斑马鱼在分析心脏再生的分服疤痕形成，使心肌再生。这个发现表明斑马鱼在分析心脏再生的分子机制方面起重要作用。子机制方面起重要作用。无忧PPT整理发布1313 DECEMBER 2002 VOL 298 SCIENCE 心脏切除后心室肌的再生 Regeneration of ventricular myocardium in the rese
8、cted zebrafish heart无忧PPT整理发布14斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用1.一般毒性评价一般毒性评价2.发育毒性评价发育毒性评价3.心血管毒性评价心血管毒性评价4.肝脏毒性评价肝脏毒性评价5.神经毒性评价神经毒性评价6.肾毒性评价肾毒性评价7.肠胃毒性评价肠胃毒性评价8.视觉毒性评价视觉毒性评价9.耳毒性评价耳毒性评价10.软骨毒性评价软骨毒性评价无忧PPT整理发布15斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用1.一般毒性评价：在化合物的一般毒性评价可在胚胎、幼一般毒性评价：在化合物的一般毒性评价可在胚胎、幼鱼、成鱼的各个阶段进行鱼、成鱼的各个阶段进
9、行,相应的观察指标略有不同。相应的观察指标略有不同。在胚胎期在胚胎期,在化合物的作用下可观察终点有卵凝结、体在化合物的作用下可观察终点有卵凝结、体节形成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率节形成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率等。幼鱼和成鱼主要是统计等。幼鱼和成鱼主要是统计LC50、死亡率等。、死亡率等。2.发育毒性评价：在胚胎发育和幼鱼发育过程中发育毒性评价：在胚胎发育和幼鱼发育过程中,很多器官很多器官系统的形成过程对药物的介人是相当敏感的系统的形成过程对药物的介人是相当敏感的,比如脑、比如脑、心血管、肝脏、软骨、脊索、胰腺、肠道、肾脏心血管、肝脏、软骨、脊索、胰腺、肠道、肾
10、脏,极易极易导致畸形的产生导致畸形的产生,是评价药物致畸性的有效模型之一。是评价药物致畸性的有效模型之一。无忧PPT整理发布16斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用3.心血管毒性评价：心脏是斑马鱼第一个发育起来并发挥心血管毒性评价：心脏是斑马鱼第一个发育起来并发挥作用的器官作用的器官,也是很多化合物的首要作用靶点。由于胚也是很多化合物的首要作用靶点。由于胚胎和幼鱼的透明性胎和幼鱼的透明性,无需借助遥测或其他技术就可以实无需借助遥测或其他技术就可以实时观察心跳、心脏的收缩性、血液循环时观察心跳、心脏的收缩性、血液循环,非常的便利。非常的便利。4.肝脏毒性评价：药物引起的肝损伤是制药业
11、一个主要的肝脏毒性评价：药物引起的肝损伤是制药业一个主要的毒理学问题。目前毒理学问题。目前,应用斑马鱼进行的肝脏毒性评价终应用斑马鱼进行的肝脏毒性评价终点主要有血清酶、肝细胞凋亡、细胞色素点主要有血清酶、肝细胞凋亡、细胞色素P450和组织和组织病理学变化。病理学变化。无忧PPT整理发布17斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用5.神经毒性评价：斑马鱼胚胎在神经毒性评价：斑马鱼胚胎在24hpf原代神经元细胞开原代神经元细胞开始分化始分化,48hpf脑室形成脑室形成,在在6dPf所有的神经系统形成所有的神经系统形成,斑斑马鱼可在短时间呈现整个神经系统马鱼可在短时间呈现整个神经系统,可作为
12、一个有机载可作为一个有机载体体,建立一个快速的、有效的评价药物神经毒性的平台建立一个快速的、有效的评价药物神经毒性的平台。6.肾毒性评价：斑马鱼的原肾由一对肾单位、两个肾小球肾毒性评价：斑马鱼的原肾由一对肾单位、两个肾小球和前肾小管组成和前肾小管组成,较为简单。庆大霉素可引起哺乳动物较为简单。庆大霉素可引起哺乳动物肾中毒肾中毒,其表型在斑马鱼原肾上也可看到其表型在斑马鱼原肾上也可看到,既肾小球滤过既肾小球滤过率降低。尽管结构的复杂程度不一样率降低。尽管结构的复杂程度不一样,但是在肾损伤表但是在肾损伤表型方面却是保守的。所以以斑马鱼为肾毒性评价载体型方面却是保守的。所以以斑马鱼为肾毒性评价载体,
13、能为药物在临床上的应用提供重要的参考价值。能为药物在临床上的应用提供重要的参考价值。无忧PPT整理发布18斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用7.胃肠毒性评价：斑马鱼的胃肠系统和人体胃肠系统有着胃肠毒性评价：斑马鱼的胃肠系统和人体胃肠系统有着千差万别千差万别,斑马鱼没有胃斑马鱼没有胃,肠道直接开始于咽部下的一小肠道直接开始于咽部下的一小段食道之后。在发育的早期肠道就开始蠕动段食道之后。在发育的早期肠道就开始蠕动,在未喂食在未喂食时就自发的游走性蠕动时就自发的游走性蠕动,由于幼鱼是透明的由于幼鱼是透明的,这些蠕动清这些蠕动清晰可见。晰可见。8.视觉毒性评价：斑马鱼有着与人类相似的锥形
14、视网膜视觉毒性评价：斑马鱼有着与人类相似的锥形视网膜,有色彩视觉有色彩视觉,这点超越了喜好夜间活动的啮齿类模式生这点超越了喜好夜间活动的啮齿类模式生物。同时物。同时,斑马鱼胚胎期视觉系统发育迅速斑马鱼胚胎期视觉系统发育迅速,幼鱼就展示幼鱼就展示了视觉介导的行为了视觉介导的行为,故可用于评价化合物对视觉的影响故可用于评价化合物对视觉的影响。无忧PPT整理发布19斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用9.耳毒性评价：斑马鱼侧线上的神经丘在结构和功能上就耳毒性评价：斑马鱼侧线上的神经丘在结构和功能上就相当于人内耳的毛细胞。神经丘在侧线上从头至尾排列相当于人内耳的毛细胞。神经丘在侧线上从头至
15、尾排列,胚胎时期在光镜下清楚可见胚胎时期在光镜下清楚可见,有助于药物作用下有助于药物作用下,观察其观察其形态和功能变化。形态和功能变化。10.软骨毒性评价：斑马鱼的骨头与人类的相似软骨毒性评价：斑马鱼的骨头与人类的相似,颅面骨骼颅面骨骼都有膜内和软骨内成骨。斑马鱼也有成骨细胞核和骨细都有膜内和软骨内成骨。斑马鱼也有成骨细胞核和骨细胞胞,并布满血管并布满血管,受神经支配。受神经支配。无忧PPT整理发布20采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒性性 1.主要试剂：雷公藤甲素主要试剂：雷公藤甲素(tripto lide),中国医中国医学科学院协和医科大学
16、皮肤病研究所学科学院协和医科大学皮肤病研究所(江苏江苏,南南京京)惠赠惠赠,纯度大于纯度大于98%.大黄素大黄素(emod in),瑞瑞雷植化制剂厂提供雷植化制剂厂提供,含量含量98%.苦参碱苦参碱(matrine),江苏天晟药业有限公司产品江苏天晟药业有限公司产品,含量含量98%.DMSO 为为S igma公司产品公司产品(美国美国)。超纯。超纯水取自水取自M illipore 超纯水机。超纯水机。无忧PPT整理发布212.方法：实验前一天禁食。取成体斑马鱼分别置方法：实验前一天禁食。取成体斑马鱼分别置于含有于含有30 50mL溶液的瓶中溶液的瓶中,保持瓶中溶液温保持瓶中溶液温度恒定在度恒定
17、在25，随机分为空白对照，随机分为空白对照,溶剂对照及溶剂对照及各药物浓度给药组各药物浓度给药组,每组含每组含15条。分别给予纯净条。分别给予纯净水水,含不同浓度药物的纯净水。含不同浓度药物的纯净水。记录不同浓度药液中斑马鱼在记录不同浓度药液中斑马鱼在24h内的死亡数内的死亡数量量(只只),计算死亡率计算死亡率(%)。根据实验结果。根据实验结果,采用采用Bliss法计算法计算LC50值值。无忧PPT整理发布223.结果：雷公藤甲素、苦参碱和大黄素对于斑马结果：雷公藤甲素、苦参碱和大黄素对于斑马鱼的鱼的LC50值依次为值依次为5.02 x10-3、113.2和和1.18 x103 ug/mL,毒性大小顺序与文献报道基本一毒性大小顺序与文献报道基本一致。致。23
