1、2023-5-23第二章第二章高效液相色谱法高效液相色谱法一、高效液相色谱仪一、高效液相色谱仪 instrument of HPLC二、高效液相色谱法的二、高效液相色谱法的特点特点 feature of HPLC三、流程及主要部件三、流程及主要部件 general process and main assembly of HPLC第一节第一节高效液相色谱的高效液相色谱的特点与仪器特点与仪器high performance liquid chromatographfeature and instrument of HPLC.2023-5-23.2023-5-23Waters LC 2695.20
2、23-5-23IC 4500i.2023-5-231.分离效能高分离效能高GC 分离效能较高，分离效能较高，n=103塔板塔板/米米，HPLC 可可达到达到 51033104 塔板塔板/米，可使用较短的柱子。米，可使用较短的柱子。二、高效液相色谱法的特点二、高效液相色谱法的特点2.选择性高选择性高HPLC 柱效高，流动相可以控制和改善分离的柱效高，流动相可以控制和改善分离的选择性。选择性。3.检测灵敏度高检测灵敏度高HPLC广泛采用高灵敏度检测器，如广泛采用高灵敏度检测器，如UV（10-9 g/mL），荧光检测器（），荧光检测器（10-11g/mL）。HPLC的优点的优点.2023-5-232
3、023-5-234.4.分析速度快分析速度快HPLC 载液流速可达载液流速可达110ml/min，完成一个样完成一个样品分析仅需几分钟到几十分钟。品分析仅需几分钟到几十分钟。5.5.应用范围广应用范围广HPLC 法不受样品沸点、挥发度和热稳定性限法不受样品沸点、挥发度和热稳定性限制，适于分析生物大分子、离子型化合物、不稳定制，适于分析生物大分子、离子型化合物、不稳定的天然物及各种高分子化合物。的天然物及各种高分子化合物。原则上相对分子量原则上相对分子量大于大于400 的有机物都可用的有机物都可用 HPLC 法分析。法分析。.2023-5-23 分析成本高，宜引起污染。分析成本高，宜引起污染。缺
4、少高灵敏度的通用型检测器。缺少高灵敏度的通用型检测器。不能替代不能替代GC完成沸程范围宽的石油产品的分完成沸程范围宽的石油产品的分析。析。操作较操作较GC复杂。复杂。HPLC的局限性的局限性.2023-5-23实际应用中，凡是能用实际应用中，凡是能用GC分析的样品一般不分析的样品一般不用用HPLC，因为，因为GC更快，更灵敏，更方便，且耗费更快，更灵敏，更方便，且耗费较低较低 。HPLC与与GC比较比较气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱只能分析挥发性物质几乎可分析各种物质不能用于热不稳定物质的分析可用于热不稳定物质的分析毛细管色谱可得到很高的柱效色谱柱不能很长、柱效不会很高有很灵敏检测器
5、和较灵敏的通用检测器没有较灵敏的通用检测器流动相为气体，无毒、易于处理流动相有毒、费用较高运行和操作容易运行和操作较气相难仪器制造难度较小仪器制造难度较大.2023-5-232023-5-23高效液相色谱仪的主要部件高效液相色谱仪的主要部件：储液罐、储液罐、高压输液泵、高压输液泵、进样装置、进样装置、色谱柱、色谱柱、检检测器、测器、记录仪和数据处理装置。记录仪和数据处理装置。工作工作流程流程.2023-5-232023-5-23一、储液罐及流动相的脱气一、储液罐及流动相的脱气1.储液罐储液罐 溶剂在放人储液罐之前必须经过溶剂在放人储液罐之前必须经过0.450.45m m滤膜过滤膜过滤滤：除去溶
6、剂中的机械杂质，以防输液管道或进除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进样阀产生阻塞现象。样阀产生阻塞现象。储液罐的材料应耐腐蚀储液罐的材料应耐腐蚀 ：常用玻璃、氟塑料或常用玻璃、氟塑料或PEEK塑料塑料，容积约为，容积约为0.52.0L。储液罐放置位置要高于泵体：储液罐放置位置要高于泵体：以保持一定的输液以保持一定的输液静压差。静压差。使用过程储液罐应密闭：使用过程储液罐应密闭：防溶剂蒸发引起流动相防溶剂蒸发引起流动相组成变化，还可防止空气中组成变化，还可防止空气中O2、CO2重新溶于已重新溶于已脱气的流动相中。脱气的流动相中。.2023-5-232023-5-232流动相脱气流动相脱气 除去
7、其中溶解气体，除去其中溶解气体，防止防止流动相由柱流至检测器流动相由柱流至检测器时，因压力降低而时，因压力降低而产生气泡产生气泡，而，而增加基线噪声增加基线噪声。使用荧光检测器，溶解在流动相中的氧气，会使用荧光检测器，溶解在流动相中的氧气，会造造成荧光猝灭。成荧光猝灭。还会导致样品中某些组分被氧化或会使柱中固定还会导致样品中某些组分被氧化或会使柱中固定相发生降解而相发生降解而改变柱的分离性能改变柱的分离性能。流动相在使用前必须进行脱气处理流动相在使用前必须进行脱气处理.2023-5-232023-5-23吹氦脱气法，吹氦脱气法，在在0.1MPa下，以约下，以约60mL/min流流速通入流动相速
8、通入流动相1015min。此法适用于所有的溶剂。此法适用于所有的溶剂，脱气效果较好，但价格较贵。，脱气效果较好，但价格较贵。加热回流法加热回流法，此法的脱气效果较好此法的脱气效果较好。抽真空脱气法抽真空脱气法，用微型真空泵除去溶解气体，用微型真空泵除去溶解气体，降压至降压至0.050.70MPa。超声波脱气法，超声波脱气法，流动相置放于超声波清洗器中流动相置放于超声波清洗器中，用超声波振荡，用超声波振荡1015min。脱气效果最差。脱气效果最差。在线真空脱气法，在线真空脱气法，真空脱气装置串接到储液系真空脱气装置串接到储液系统中，使流动相进入输液泵前连续真空脱气。此统中，使流动相进入输液泵前连
9、续真空脱气。此法脱气效果最好，适于多元溶剂体系法脱气效果最好，适于多元溶剂体系。常用的脱气方法常用的脱气方法.2023-5-232023-5-23.2023-5-232023-5-23二、高压输液泵二、高压输液泵1.高压泵性能高压泵性能 有足够的输出压力有足够的输出压力：压力范围压力范围250400kg/cm2。输出流量恒定：输出流量恒定：流量精密度应在流量精密度应在1%，无脉动。，无脉动。流量范围宽：流量范围宽：分析仪器应在分析仪器应在0.1 10.0ml/min。制备仪器制备仪器1100ml/min。抗溶剂的腐蚀：抗溶剂的腐蚀：常用不锈钢和常用不锈钢和PEEK塑料塑料。泵死体积要小；泵死体
10、积要小；以便迅速更换溶剂和梯度洗提。以便迅速更换溶剂和梯度洗提。.2023-5-232023-5-232.高压泵分类：高压泵分类：恒流泵：恒流泵：输出流量恒定，与柱引起阻力无关。输出流量恒定，与柱引起阻力无关。恒压泵：恒压泵：输出压力恒定，与柱引起阻力无关。输出压力恒定，与柱引起阻力无关。(1)(1)恒流泵：恒流泵：常用往复式柱塞泵和注射泵。常用往复式柱塞泵和注射泵。特点：特点：流量恒定，液腔体积小（流量恒定，液腔体积小（0.1ml），更换），更换溶剂和梯度洗提方便，但有脉动，应用广泛。溶剂和梯度洗提方便，但有脉动，应用广泛。.2023-5-232023-5-23.2023-5-232023-
11、5-23(2)(2)恒压泵：恒压泵：常用气动泵常用气动泵根据压力传导原理设计的，即根据压力传导原理设计的，即 P1.SA=P2.SBP1 低压，推动大面积低压，推动大面积 SA，则在小面积，则在小面积 SB 活塞活塞输出大压力输出大压力P2。特点：特点：压力恒定，无脉动，液腔体积较大，更压力恒定，无脉动，液腔体积较大，更换流动相不方便。当泵的负荷阻力小时可提供大的换流动相不方便。当泵的负荷阻力小时可提供大的输出流量，适于匀桨法填装柱子。输出流量，适于匀桨法填装柱子。.2023-5-232023-5-233梯度洗脱装置梯度洗脱装置梯度洗提：梯度洗提：在分离过程中按一定的程序连续改在分离过程中按一
12、定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性。变载液中溶剂的配比和极性。通过载液极性改变来改变分离因素，改善通过载液极性改变来改变分离因素，改善分离分离效果、缩短分析时间、改善峰形，提高分析精度。效果、缩短分析时间、改善峰形，提高分析精度。高压梯度（高压梯度（内梯度）内梯度）两台高压泵，将两种两台高压泵，将两种不同极性溶剂按一定比例不同极性溶剂按一定比例送入梯度混合室，混合后送入梯度混合室，混合后进入色谱柱进入色谱柱。.2023-5-232023-5-23.2023-5-232023-5-23低压梯度低压梯度（外梯度）（外梯度）:一台高压泵一台高压泵,通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种或多种将两种
13、或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。.2023-5-232023-5-23.2023-5-232023-5-23流路中为高压力工作状态；流路中为高压力工作状态；通常使用耐高压的六通阀进样装置；通常使用耐高压的六通阀进样装置；特点：特点：耐高压，进样的重现性好，易于自动化，耐高压，进样的重现性好，易于自动化，易造成色谱峰柱前扩宽。易造成色谱峰柱前扩宽。.2023-5-232023-5-23装入状态装入状态出口出口进样状态进样状态采样环采样环泵入溶剂泵入溶剂进色谱柱进色谱柱.2023-5-232023-5-23发展趋势是减小填料粒度和柱径以
14、提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。柱材：柱材：一般采用不锈钢管和一般采用不锈钢管和 PEEK 塑料。塑料。柱型及尺寸：柱型及尺寸：一般采用管内径一般采用管内径16 mm，柱长，柱长540 cm直型柱，标准柱型直型柱，标准柱型3.9 或或 4.6mm，L 15、30cm。填料粒度：填料粒度：510 m，柱效，柱效500010000，35 m，L 510cm。.2023-5-232023-5-23理想的理想的HPLC 检测器应具备的特检测器应具备的特性性灵敏度高；灵敏度高；对所有溶质都对所有溶质都有快速响应；有快速响应；响应对流动相响应对流动相流量和温度变化不流量和温度变化不敏感；
15、敏感；线性范围宽；线性范围宽；不引起柱外扩不引起柱外扩散。散。至今没有一种至今没有一种检测器完全具备。检测器完全具备。常用的检测器常用的检测器UVD；RID；ECD；FLD。.2023-5-232023-5-23 紫外检测器紫外检测器 溶质性质检测溶质性质检测器。器。构造：构造：.2023-5-23 特点：特点：灵敏度高灵敏度高(10-9g/mL），线性范围宽，易），线性范围宽，易于操作，对流动相的流速和温度变化不敏感，适于操作，对流动相的流速和温度变化不敏感，适用于梯度洗脱。用于梯度洗脱。应用：应用：HPLC中使用最为广泛中使用最为广泛。基于被测组分对紫外光的选择性吸收，其吸光基于被测组分对
16、紫外光的选择性吸收，其吸光度与试样中组分浓度成正比，度与试样中组分浓度成正比，检测原理：检测原理：即即 A C。.2023-5-232023-5-23 无组分进入时，测量池和参比池只通过流动相，无组分进入时，测量池和参比池只通过流动相，光电管接受的辐射强度相等，无信号输出。光电管接受的辐射强度相等，无信号输出。组分进入时，其吸收一定紫外光，光电管接受组分进入时，其吸收一定紫外光，光电管接受到辐射强度不等，有信号输出。到辐射强度不等，有信号输出。.2023-5-232023-5-23二级管阵列检测器是二级管阵列检测器是UV检测器的重要进展，检测器的重要进展，光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检
17、测器：1024个二极管阵列，各个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理。检测特定波长，计算机快速处理。与普通与普通UVD的区别的区别进入检测器流通池的进入检测器流通池的不再是单色光不再是单色光；获得的检；获得的检测信号不是单一波长上的，而是全部紫外光波长上测信号不是单一波长上的，而是全部紫外光波长上的信号。可提供组分的光谱信息，利于定性分析。的信号。可提供组分的光谱信息，利于定性分析。.2023-5-232023-5-23光源发出的辐射（氘灯）光源发出的辐射（氘灯）吸收池吸收池光栅（全光栅（全息）息）二级管阵列检测器，并用电子学方法和计算二级管阵列检测器，并用电子学方法和计算机技术采集数据
18、机技术采集数据可得三维色谱图光谱图可得三维色谱图光谱图.2023-5-232023-5-23.2023-5-232023-5-23.2023-5-232023-5-23 特点：特点：w 最大优点是同时获得吸收值是保留时间和波长最大优点是同时获得吸收值是保留时间和波长函数的函数的三维图。三维图。w 可利用色谱保留值规律及光谱特征吸收曲线综可利用色谱保留值规律及光谱特征吸收曲线综合合进行定性分析。进行定性分析。w 可对每个色谱峰的指定位置（峰前沿、顶、尾）可对每个色谱峰的指定位置（峰前沿、顶、尾）进行光谱比较，以进行光谱比较，以判断色谱峰的纯度及分离情判断色谱峰的纯度及分离情况。况。w 目前灵敏度
19、不及目前灵敏度不及UVD。.2023-5-232023-5-23整体性质检测器，普及程度仅次于整体性质检测器，普及程度仅次于UVD。（3）示差折光检测器示差折光检测器（RID）检测原理：检测原理：通过连续测定通过连续测定参比参比流通池中流通池中和样品流和样品流通池中通池中溶液折射率的溶液折射率的差值差值方法，来测定试样浓度。方法，来测定试样浓度。crrrr参参比比池池样样品品池池折射率的差值与折射率的差值与组分的浓度成正比组分的浓度成正比.2023-5-232023-5-23 特点：特点：1.通用型检测器，几乎每种物质都有各自的折射率通用型检测器，几乎每种物质都有各自的折射率都可用差示折光检测
20、器检测；都可用差示折光检测器检测；2.灵敏度低，可以达到灵敏度低，可以达到10-7g/mL；3.对温度、流量变化敏感；对温度、流量变化敏感；4.不能用于梯度洗脱。不能用于梯度洗脱。.2023-5-232023-5-23 检测原理：检测原理：光源发出紫外光光源发出紫外光单色单色器器1吸收池（光被吸收，吸收池（光被吸收，激发组分）产生荧光激发组分）产生荧光单色单色器器2光电倍增管，光电倍增管，产生的产生的荧光强度与组分浓度成正比。荧光强度与组分浓度成正比。（4）荧光检测器（荧光检测器（FLD）荧光检测器是一种高灵敏度的选择性检测器。荧光检测器是一种高灵敏度的选择性检测器。构造及光路构造及光路.2023-5-232023-5-23 特点：特点：1.灵敏度高，比灵敏度高，比UVD高高102，适用于痕量分析，适用于痕量分析;2.有选择性有选择性;3.线性范围较低，约为线性范围较低，约为103;4.可用于梯度洗脱；可用于梯度洗脱；5.操作比较复杂。操作比较复杂。应用：应用：共轭结构的有机芳环分子，如多环芳烃、维共轭结构的有机芳环分子，如多环芳烃、维生素、黄曲霉素、许多生化物质和代谢产物、药生素、黄曲霉素、许多生化物质和代谢产物、药物、胺类、氨基酸、甾族化合物，非荧光物质也可物、胺类、氨基酸、甾族化合物，非荧光物质也可通过荧光试剂反应变成荧光物质后检测。通过荧光试剂反应变成荧光物质后检测。.
