1、第十章第十章 生物制品生物制品l一、生物制品概述l二、疫苗研究及其研制策略l三、生物制品的一般制造方法、质量要求 与检定l四、重要生物制品的制备l五、核酸疫苗第一节：生物制品概述l 1 概念及发展沿革概念及发展沿革l 2 生物制品的分类生物制品的分类l 3 制造生物制品的生物学及免疫学基础制造生物制品的生物学及免疫学基础1 概念及发展沿革概念及发展沿革l1.1 概念概念l 凡是从微生物及其代谢产物、原虫、动物毒素、人或凡是从微生物及其代谢产物、原虫、动物毒素、人或动物的血液或组织直接加工制成，或用现代生物技术、化动物的血液或组织直接加工制成，或用现代生物技术、化学方法制成，作为预防、治疗、诊断
2、特定传染病或其他有学方法制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的关疾病的免疫制剂免疫制剂。l 包括各种包括各种疫苗、抗血清、抗毒素、类毒素、免疫调节剂、疫苗、抗血清、抗毒素、类毒素、免疫调节剂、诊断试剂诊断试剂等。等。1.2 从疫苗生产看生物制品的发展从疫苗生产看生物制品的发展l 12世纪，中国开始用人痘接种预防天花，从症状轻微的天花世纪，中国开始用人痘接种预防天花，从症状轻微的天花病人身上人工接染到健康儿童，使其通过产生轻微症状的感病人身上人工接染到健康儿童，使其通过产生轻微症状的感染获得免疫力，避免天花引起的严重疾病甚至死亡。染获得免疫力，避免天花引起的严重疾病甚至死亡。l 1
3、721年年，人痘接种法传入英国，英国医生，人痘接种法传入英国，英国医生琴纳琴纳注意到感染过注意到感染过牛痘的人不会再感染天花。经过多次实验，琴纳于牛痘的人不会再感染天花。经过多次实验，琴纳于1796年从年从一挤奶女工感染的痘疱中，取出疱浆，接种于一挤奶女工感染的痘疱中，取出疱浆，接种于8岁男孩的手臂岁男孩的手臂上，然后让其接种天花脓疱液，结果该男孩并未染上天花，上，然后让其接种天花脓疱液，结果该男孩并未染上天花，证明其对天花确实具有了免疫力。证明其对天花确实具有了免疫力。l 最早的弱毒活病毒疫苗。1.2 从疫苗生产看生物制品的发展从疫苗生产看生物制品的发展l 1798年年，医学界正式承认，医学
4、界正式承认“疫苗接种确实是一种行之有疫苗接种确实是一种行之有效的免疫方法效的免疫方法”。l 经过一百多年的努力，经过一百多年的努力，1980年年世界卫生组织宣布全球世界卫生组织宣布全球消消灭灭了了天花天花。l 1870年年，法国科学家，法国科学家巴斯德巴斯德发明了第一个细菌减毒活疫发明了第一个细菌减毒活疫苗苗鸡霍乱疫苗。巴斯德将此归纳为对动物接种什么细鸡霍乱疫苗。巴斯德将此归纳为对动物接种什么细菌就可以使其不受该病菌感染的菌就可以使其不受该病菌感染的免疫接种原理免疫接种原理，从而奠定，从而奠定了疫苗的理论基础。因此人们把巴斯德称为疫苗之父。了疫苗的理论基础。因此人们把巴斯德称为疫苗之父。1.2
5、 从疫苗生产看生物制品的发展从疫苗生产看生物制品的发展l 第二代疫苗第二代疫苗亚基疫苗的出现，克服了第一代疫苗潜在亚基疫苗的出现，克服了第一代疫苗潜在致病性的问题。致病性的问题。天然或重组成分为主。天然或重组成分为主。l 第三代疫苗第三代疫苗核酸疫苗，调动细胞免疫和体液免疫两个核酸疫苗，调动细胞免疫和体液免疫两个系统，追求最佳效果。系统，追求最佳效果。持久，广谱，廉价。持久，广谱，廉价。2 生物制品的分类生物制品的分类l 1.疫苗等预防类生物制品疫苗等预防类生物制品：细菌类疫苗、病毒类疫苗、类：细菌类疫苗、病毒类疫苗、类毒素和联合疫苗。毒素和联合疫苗。l 2.抗毒素及免疫血清：抗毒素及免疫血清
6、：由特定抗原免疫动物所得血浆制成由特定抗原免疫动物所得血浆制成的抗毒素或免疫血清，如破伤风抗毒素、抗狂犬病血清等，的抗毒素或免疫血清，如破伤风抗毒素、抗狂犬病血清等，用于治疗或被动免疫预防。用于治疗或被动免疫预防。l 3.血液制品：血液制品：如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重组的）、红细胞浓缩物等。（天然或重组的）、红细胞浓缩物等。l 4.诊断制品：诊断制品：包括体内诊断制品和体外诊断制品。包括体内诊断制品和体外诊断制品。3 制造生物制品的生物学及免疫学基础制造生物制品的生物学及免疫学基础l 3.1 生物学基础生物学基础l A:细菌的代谢产物
7、细菌的代谢产物。l(1)热原质热原质 主要是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，注入体主要是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，注入体内能引起发热反应。内能引起发热反应。l(2)毒素毒素 有内毒素和外毒素两种，均有强烈毒性。有内毒素和外毒素两种，均有强烈毒性。l(3)色素色素 许多细菌能产生色素，对其鉴别有用。许多细菌能产生色素，对其鉴别有用。lB:外界环境因素对微生物的影响外界环境因素对微生物的影响 一方面可创造有利条件，促进它们的生一方面可创造有利条件，促进它们的生长繁殖，以制备生物制品；另一方面也可长繁殖，以制备生物制品；另一方面也可利用对微生物不利的因素使其发生变异或利用对微生物不利的因素使其发生变异
8、或杀灭之，以更好地为制造生物制品服务。杀灭之，以更好地为制造生物制品服务。l常用的几个概念：常用的几个概念：消毒；灭菌；无菌；防腐。消毒；灭菌；无菌；防腐。3.2 免疫学基础免疫学基础3.2.1 机体的抗感染免疫机体的抗感染免疫l 1)先天性免疫先天性免疫（非特异性免疫）（非特异性免疫）包括：包括：体表屏障体表屏障，如皮肤粘膜屏障；，如皮肤粘膜屏障；血脑屏障血脑屏障，防御病原微生物及其毒性产，防御病原微生物及其毒性产物从血流侵入脑组织；物从血流侵入脑组织；细胞吞噬作用细胞吞噬作用；正常体液和组织中的抗菌物质正常体液和组织中的抗菌物质。l2)特异性免疫特异性免疫：个体在生命过程中接受抗原刺激后主
9、动产生或个体在生命过程中接受抗原刺激后主动产生或被动获得的。又称获得性免疫。被动获得的。又称获得性免疫。包括自动免疫和被动免疫。包括自动免疫和被动免疫。自自 然然 自自 动动 免免 疫疫：患患 传传 染染 病病，隐隐 性性 感感 染染自自 动动 免免 疫疫人人 工工 自自 动动 免免 疫疫：接接 种种 疫疫 苗苗，类类 毒毒 素素自自 然然 被被 动动 免免 疫疫：经经 胎胎 盘盘，初初 乳乳特特 异异 性性 免免疫疫被被 动动 免免 疫疫人人 工工 被被 动动 免免 疫疫：注注射射抗抗毒毒素素，丙丙种种球球蛋蛋白白，细细胞胞因因子子人工免疫人工免疫 人为的给机体输入抗原以调动机体的免疫系统，
10、人为的给机体输入抗原以调动机体的免疫系统，或直接输入免疫血清，使获得某种特殊抵抗力，用以预或直接输入免疫血清，使获得某种特殊抵抗力，用以预防或治疗某些疾病者，称防或治疗某些疾病者，称人工免疫人工免疫。人工主动免疫人工主动免疫(artificial active immunization)：是指给机：是指给机体接种体接种抗原性物质抗原性物质如疫苗，类毒素等，刺激机体免疫系如疫苗，类毒素等，刺激机体免疫系统产生特异性免疫力的方法。统产生特异性免疫力的方法。3.2.2 人工免疫人工免疫人人 工工 自自 动动 免免 疫和人疫和人 工工 被被 动动 免免 疫的比较疫的比较区别点区别点人人 工工 自自 动
11、动 免免 疫疫人人 工工 被被 动动 免免 疫疫接种物接种物疫苗，类毒素疫苗，类毒素抗体抗体（抗毒素，丙球）（抗毒素，丙球）免疫出现时间免疫出现时间慢，慢，1-4 周周快，立即快，立即免疫力维持时间免疫力维持时间长长（数月（数月-数年）数年）较短较短（2 周周-数周）数周）用途用途主要用于预防主要用于预防多用于紧急预防和治疗多用于紧急预防和治疗人工被动免疫人工被动免疫(artificial passive immunization):是给人体注射含特异性抗体的是给人体注射含特异性抗体的免疫血清免疫血清或或细胞因子等制剂，使受者迅速获得特异性免疫细胞因子等制剂，使受者迅速获得特异性免疫力的方法。
12、力的方法。3.3 人工自动免疫类生物制品人工自动免疫类生物制品疫苗疫苗（Vaccine）：细菌，病毒，螺旋体，立克次体和类毒素）：细菌，病毒，螺旋体，立克次体和类毒素等抗原性生物制品统称为疫苗。等抗原性生物制品统称为疫苗。安全安全 有效有效 实用实用分类分类1）死疫苗）死疫苗（death vaccine）:选用免疫原性强的微生物标准株选用免疫原性强的微生物标准株经大量培养后，用物理或化学方法将其经大量培养后，用物理或化学方法将其杀死或灭活杀死或灭活而制成的而制成的预防制剂。如霍乱、百日咳、伤寒、钩端螺旋体疫苗。预防制剂。如霍乱、百日咳、伤寒、钩端螺旋体疫苗。优点：主要诱导特异性抗体产生，安全优
13、点：主要诱导特异性抗体产生，安全缺点：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反应严重缺点：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反应严重2）减毒活疫苗）减毒活疫苗（live-attenuated Vaccine）用人工定向变异或从自然界筛选得到的用人工定向变异或从自然界筛选得到的毒力高度减弱或毒力高度减弱或基本无毒基本无毒的病原微生物制成的预防制剂。的病原微生物制成的预防制剂。优点：一次免疫即可获得长久免疫力，类似自然状态下的优点：一次免疫即可获得长久免疫力，类似自然状态下的轻型或隐性感染。诱导体液免疫和细胞免疫。轻型或隐性感染。诱导体液免疫和细胞免疫。缺点：不易保存，存在回复突变的危险缺点：不易
14、保存，存在回复突变的危险 如卡介苗如卡介苗 牛痘牛痘 麻疹等麻疹等死死疫疫苗苗活活疫疫苗苗制制剂剂性性状状杀杀死死的的病病原原微微生生物物弱弱毒毒或或无无毒毒的的病病原原微微生生物物接接种种量量及及次次数数量量大大，2-3 次次量量小小，1 次次保保存存及及有有效效期期易易保保存存，较较稳稳定定，有有效效期期一一年年不不易易保保存存，4 度度数数周周失失效效免免疫疫效效果果较较差差，维维持持数数月月至至一一年年较较好好，维维持持 1-5 年年或或更更长长3）类毒素（）类毒素（Toxid）细菌外毒素经细菌外毒素经0.3-0.4%甲醛处理，使其毒性减弱而保留甲醛处理，使其毒性减弱而保留其免疫原性。
15、其免疫原性。白百破：白喉类毒素白百破：白喉类毒素+百日咳杆菌死疫苗百日咳杆菌死疫苗+破伤风类毒素破伤风类毒素4）新型疫苗）新型疫苗（1）亚单位疫苗）亚单位疫苗（Subunit Vaccine）是去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成是去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。优点：免疫效果高，优点：免疫效果高，不良反应少不良反应少（2）合成肽疫苗）合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)将具有保护性免疫力的人工合成肽与适当载体结合后，将具有保护性免疫力的人工合成肽与适当载体结合后，再加入佐剂
16、制成的疫苗。再加入佐剂制成的疫苗。乙肝病毒多肽疫苗乙肝病毒多肽疫苗（3）基因工程疫苗）基因工程疫苗DNA 疫苗疫苗（DNA Vaccine）是用编码病原体有效免疫原的基因与细菌质粒构建的重是用编码病原体有效免疫原的基因与细菌质粒构建的重组体直接免疫机体，转染宿主细胞，使其表达保护性抗原，组体直接免疫机体，转染宿主细胞，使其表达保护性抗原，从而诱导机体产生特异性免疫的疫苗。从而诱导机体产生特异性免疫的疫苗。优点：体内可持续表达，免疫效果好，维持时间长。优点：体内可持续表达，免疫效果好，维持时间长。缺点：其机制和安全性尚不完全清楚，一些问题有待解决。缺点：其机制和安全性尚不完全清楚，一些问题有待解
17、决。重组抗原疫苗重组抗原疫苗(recombinant antigen vaccine)是利用是利用DNA重组技术制备的只含保护性抗原的纯化疫苗。重组技术制备的只含保护性抗原的纯化疫苗。优点：不含活的病原体和病毒核酸，安全有效，成本低廉。优点：不含活的病原体和病毒核酸，安全有效，成本低廉。目前获准使用的有乙型肝炎疫苗。目前获准使用的有乙型肝炎疫苗。重组载体疫苗重组载体疫苗(recombinant vector vaccine)是将编码病原体有效免疫原的基因插入是将编码病原体有效免疫原的基因插入载体（减毒的病毒载体（减毒的病毒或细菌疫苗株）或细菌疫苗株）基因组中，接种后，随疫苗株在体内的增殖，基因
18、组中，接种后，随疫苗株在体内的增殖，大量所需的抗原得以表达。如果将多种病原体的有关基因插入大量所需的抗原得以表达。如果将多种病原体的有关基因插入载体，则成为可表达多种保护性抗原的多价疫苗。载体，则成为可表达多种保护性抗原的多价疫苗。载体：载体：痘苗病毒痘苗病毒转基因植物疫苗转基因植物疫苗 用转基因方法，将编码有效免疫原的基因导入用转基因方法，将编码有效免疫原的基因导入可食用植物可食用植物细胞细胞的基因组中，免疫原即可在植物的可食用部分稳定的表达的基因组中，免疫原即可在植物的可食用部分稳定的表达和积累，人类和动物通过摄食达到免疫接种的目的。常用的植和积累，人类和动物通过摄食达到免疫接种的目的。常
19、用的植物有蕃茄、马铃薯、香蕉等。物有蕃茄、马铃薯、香蕉等。（一）特异性免疫治疗剂（一）特异性免疫治疗剂1）抗毒素）抗毒素 利用类病毒注射动物，产生利用类病毒注射动物，产生特异性抗体特异性抗体，经采血、分，经采血、分离、纯化后制成的产品。离、纯化后制成的产品。2）抗病毒血清）抗病毒血清 用病毒作抗原免疫动物制备的含有抗体的用病毒作抗原免疫动物制备的含有抗体的血清血清生物制品。生物制品。3.4 人工被动免疫类生物制品人工被动免疫类生物制品还有：抗菌血清、免疫球蛋白、免疫核糖核酸等还有：抗菌血清、免疫球蛋白、免疫核糖核酸等（二）非特异性免疫治疗剂（二）非特异性免疫治疗剂-免疫调节剂免疫调节剂1）转移
20、因子）转移因子2）白细胞介素）白细胞介素6）小棒杆菌）小棒杆菌3）胸腺素）胸腺素4）细胞毒）细胞毒T细胞细胞5）卡介苗）卡介苗7）干扰素）干扰素第二节 疫苗l疫苗的现代定义为疫苗的现代定义为：一切通过注射或黏膜：一切通过注射或黏膜途径接种，可以诱导机体产生针对特定致途径接种，可以诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得体获得保护或消灭该致病原保护或消灭该致病原能力的生物制能力的生物制品统称为疫苗，包括蛋白质、多糖、核酸、品统称为疫苗，包括蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染因子。活载体或感染因子。l预防用生物制品按所用材料一般分预防用生物
21、制品按所用材料一般分细菌类细菌类及其类毒素类疫苗、病毒类疫苗、蛋白疫及其类毒素类疫苗、病毒类疫苗、蛋白疫苗和核酸疫苗苗和核酸疫苗四大类。四大类。1 接种目的及作用l接种目的 防止病原体进入机体 建立抗感染免疫l口服或注射疫苗 激发宿主产生抗病原体的抗体 暴露于病原体也不会生病 进入机体的病原体被抗体失活2 疫苗的种类l 从疫苗研制技术又可将疫苗分为从疫苗研制技术又可将疫苗分为传统疫苗传统疫苗和和新型疫苗新型疫苗两大类。两大类。l 2.1常规疫苗l 1）疫苗）疫苗 （1）活疫苗：减毒活疫苗（卡介苗）活疫苗：减毒活疫苗（卡介苗）（2）死疫苗（百日咳、霍乱等）死疫苗（百日咳、霍乱等）l 2）类毒素）
22、类毒素 破伤风类毒素、白喉类毒素破伤风类毒素、白喉类毒素l 3）自身疫苗）自身疫苗 由病人自身病灶中分离出的病原体制成的死疫苗。由病人自身病灶中分离出的病原体制成的死疫苗。2.2 新型疫苗l 1）亚单位疫苗 一类保留病原体中有效免疫原成分，而除去无效成一类保留病原体中有效免疫原成分，而除去无效成分和有毒成分的化学纯疫苗。分和有毒成分的化学纯疫苗。乙肝亚单位疫苗l 2）化学疫苗 用化学方法提取病原体中有效免疫原成分体制成的用化学方法提取病原体中有效免疫原成分体制成的化学纯疫苗，比亚单位疫苗更为简单。化学纯疫苗，比亚单位疫苗更为简单。肺炎链球菌荚膜多糖l 3）多肽疫苗 人工合成的高免疫原性多肽片段
23、制成的疫苗。人工合成的高免疫原性多肽片段制成的疫苗。乙型肝炎表面抗原的各种合成肽段l 4）基因工程疫苗 利用基因工程构建重组基因序列，表达免疫原性强、利用基因工程构建重组基因序列，表达免疫原性强、无毒性的多肽制成的疫苗。无毒性的多肽制成的疫苗。乙型肝炎基因工程疫苗l 5）DNA疫苗 用编码抗原基因制成的疫苗。用编码抗原基因制成的疫苗。流感病毒核蛋白DNA疫苗l 通常也习惯地将通常也习惯地将遗传重组疫苗、合成肽疫苗和抗独特遗传重组疫苗、合成肽疫苗和抗独特型抗体疫苗型抗体疫苗包括在新型疫苗范畴。包括在新型疫苗范畴。3 疫苗的基本成分、性质和特征l 3.1 疫苗的基本成分疫苗的基本成分 疫苗的基本成
24、分疫苗的基本成分包括包括抗原、佐剂、防腐剂、抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂稳定剂、灭活剂及其他活性成分。及其他活性成分。抗原抗原，是疫苗最主要的有效活性成分，它，是疫苗最主要的有效活性成分，它决定了疫苗的特异免疫原性。构成抗原的三个决定了疫苗的特异免疫原性。构成抗原的三个基本条件：基本条件：异物性异物性、特异性特异性和一定的和一定的理化特性理化特性。l 可用作抗原的生物活性物质可用作抗原的生物活性物质有：有：灭活病毒或细菌、灭活病毒或细菌、活病毒活病毒或细菌通过实验室多次传代得到的或细菌通过实验室多次传代得到的减毒株、减毒株、病毒或菌体提纯物、有效蛋白成分、类毒素、细病毒或菌体提纯物、有效
25、蛋白成分、类毒素、细菌多糖、合成多肽菌多糖、合成多肽以及近年来发展以及近年来发展DNA疫苗所用疫苗所用的的核酸核酸等。等。l 佐剂佐剂，能，能增强增强抗原的抗原的特异性免疫应答特异性免疫应答。目前常用。目前常用的有的有铝佐剂铝佐剂和和油制佐剂油制佐剂。l 3.2 疫苗的基本性质疫苗的基本性质 包括包括免疫原性、安全性、稳定性免疫原性、安全性、稳定性。l 免疫原性免疫原性：指疫苗接种进入机体后引起机体产生：指疫苗接种进入机体后引起机体产生免疫应答的强度和持续时间。免疫应答的强度和持续时间。l 影响的因素影响的因素包括机体的因素和疫苗的因素。从疫包括机体的因素和疫苗的因素。从疫苗的角度看是由疫苗的
26、抗原决定的。包括苗的角度看是由疫苗的抗原决定的。包括抗原的抗原的强弱、大小和稳定性以及抗原的理化性质强弱、大小和稳定性以及抗原的理化性质。4 疫苗制备的基本过程l 疫苗因种类不同，其制备方法也不相同，但总的来疫苗因种类不同，其制备方法也不相同，但总的来说，说，经典疫苗制备经典疫苗制备的基本过程包括：的基本过程包括：选择适宜的培选择适宜的培养基或细胞，进行菌、毒株大量繁殖，收集培养物，养基或细胞，进行菌、毒株大量繁殖，收集培养物，提纯，半成品检定，稀释，分装，成品检定提纯，半成品检定，稀释，分装，成品检定。二、病毒类疫苗制造方法 疫苗制备工艺各异，但主要程序一致。疫苗制备工艺流程1、毒种的选择和
27、减毒、毒种的选择和减毒l毒株必须满足的条件具有特定抗原性：能使机体诱发特定的免疫力足以阻止有关的病原体的侵入或防止机体发生相应的疾病。具有典型形态，感染特定组织的特性，并在传代过程中能长期保持生物学特性。毒株易在特定的组织中大量繁殖。人工繁殖，不产生毒素无毒力回复不被病毒感染2 病毒繁殖病毒繁殖l（1）活体动物培养：将病毒接种动物的鼻腔、腹腔、脑腔或皮下繁殖。l 如：牛痘 牛皮下，乙脑 鼠脑等。生产中已淘汰。l（2）鸡胚培养：接种到714d幼龄鸡胚的尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜处繁殖。较动物管理方便。易受支 原体，沙门菌污染。l（3）组织培养。广泛用于病毒培养。l（4）细胞培养。3、细胞培养条件
28、l 维持细胞培养所需的最佳条件 在大规模培养动物细胞的过程中，最根本的是使细胞的培养条件达到最优化，尽可能消除或减轻环境对细胞的影响，维持细胞高存活力和高效表达，同时又要充分考虑细胞表达产物的后续纯化。配制细胞生长最适合的培养基 常用维持液和生长液 Eagle、RPM1640,DEME等作为维持液，加入牛血清为生长液。细胞培养环境细胞培养环境 影响细胞培养的主要因素有影响细胞培养的主要因素有:CO2、溶氧、溶氧(DO)、温度、温度、pH值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛(MG)、培养基、培养基成分等。成分等。l细胞培养环境细胞培养环境l最适最适CO2水平为水平为4
29、%10%，l溶氧维持在溶氧维持在20%50%，l温度大多数在温度大多数在37，lpH值在值在7.07.4之间。之间。l控制细菌污染，加入青霉素、链霉素控制细菌污染，加入青霉素、链霉素l培养时间培养时间24天。天。l培养容器内壁洁净度。培养容器内壁洁净度。l葡萄糖是细胞培养过程中主要的能量来源，必须葡萄糖是细胞培养过程中主要的能量来源，必须维持在一定水平。维持在一定水平。3 疫苗的灭活疫苗的灭活l 原则：充分破坏疫苗的毒力，尽量减少疫苗免疫力损失。l 0.20.4的甲醛或酚溶液。4 疫苗的纯化疫苗的纯化l 去除存在的动物组织，降低接种不良反应。5 冻干冻干l 升华，不使疫苗融解。疫苗稳定性提高1
30、倍以上。三、细菌类疫苗和类毒素的一般制造方法l细菌类疫苗和类毒素均由细菌培养开始，制备的主要程序相似。细菌类疫苗对菌体进一步加工 类毒素对细菌分泌的外毒素加工疫苗和类毒素制备工艺流程1 菌种的选择菌种的选择抗原性典型形态，培养特性和理化特性易于在人工培养基上培养，不产生毒素培养过程中毒性小（死菌疫苗）或无毒力回复（活菌疫苗）制备毒素时需培养过程中产生大量的典型毒素l 2培养基的营养要求培养基的营养要求l碳、氮源和无机盐等必需外，有时需添加生长因子。l结核杆菌以甘油为碳源，百日咳杆菌需要谷氨酸，胱氨酸为氮源。l 3 培养条件控制培养条件控制 氧分压、温度、pH、避光、渗透压等l 4 杀菌杀菌l彻
31、底杀死细菌不影响防病效力l 5 稀释、分装和冻干稀释、分装和冻干l含防腐剂的NS稀释，无菌分装。四、生物制品质量要求与检定l 生物制品质量的特殊重要性生物制品质量的特殊重要性所有预防制品都是直接用于大量健康人群（儿童）所有预防制品都是直接用于大量健康人群（儿童）所用治疗制品都是通过非胃肠途径直接用于患者所用治疗制品都是通过非胃肠途径直接用于患者诊断试剂，其质量则关系到能否对患者或试样做出特异、诊断试剂，其质量则关系到能否对患者或试样做出特异、敏感的正确诊断和分析敏感的正确诊断和分析l 生物制品的质量生物制品的质量安全性安全性有效性有效性可接受性可接受性l 生物制品的生物制品的GMP管理管理药品
32、生产质量管理规范药品生产质量管理规范GMP（Good Manufacturing Practices for Drugs）：是对生物制品生产全过程的质量管理，涉及人员、厂房是对生物制品生产全过程的质量管理，涉及人员、厂房和设备、原料采购入库、检验、发料，加工，在制品及和设备、原料采购入库、检验、发料，加工，在制品及半成品检验，分包装，成品检定，出品销售，运输，用半成品检验，分包装，成品检定，出品销售，运输，用户意见及使用反应处理等在内的全过程的质量管理。户意见及使用反应处理等在内的全过程的质量管理。主要包括以下三个方面：人员、厂房和设备和原材料主要包括以下三个方面：人员、厂房和设备和原材料（硬
33、件）、管理制度和要求（软件）（硬件）、管理制度和要求（软件）1 生物制品的标准化1.1 生物制品规程生物制品规程中国生物制品规程中国生物制品规程是我国生物制品生产、是我国生物制品生产、检定、经营和使用的技术法规，是监督检检定、经营和使用的技术法规，是监督检 验生验生物制品质量的法定标准。物制品质量的法定标准。1.2 生物制品标准物质生物制品标准物质定义定义：系指用于生物制品效价、活性或含量测系指用于生物制品效价、活性或含量测定的或其特性鉴别、检查的生物标准品或生物定的或其特性鉴别、检查的生物标准品或生物参考物质。参考物质。l国际标准品，由国际标准品，由WHO制备、审定和分发制备、审定和分发l国
34、家生物标准品，由国家生物标准品，由国家鉴定机构国家鉴定机构制备、审制备、审定和分发定和分发种类：种类：v国际标准品国际标准品v国际参考品国际参考品v国际生物参考试剂国际生物参考试剂种类：种类：v国家生物标准品国家生物标准品v国家生物参考品国家生物参考品v国家生物参考试剂国家生物参考试剂3.1 生物制品的标准化l 3.1.2 生物制品标准物质生物制品标准物质种类种类l国家生物标准品国家生物标准品l国家生物参考品国家生物参考品国家国家生物生物标准品标准品，系指用国际系指用国际生物生物标准品标定的，标准品标定的，或由我国自或由我国自行研制的（尚无国际生物标准品者）行研制的（尚无国际生物标准品者）用于
35、用于定量测定定量测定某一制品某一制品效效价价或毒性的或毒性的标准标准物质，其生物物质，其生物学学活性以国际单位活性以国际单位（IU）或以单）或以单位（位（U）表示。表示。国家国家生物生物参考品参考品，系指用国际，系指用国际生物生物参考品标定的，参考品标定的，或由我国自行研或由我国自行研制的（尚无国际生物标准品者）用于微生物（或其产物）的定性鉴制的（尚无国际生物标准品者）用于微生物（或其产物）的定性鉴定或疾病诊断的生物试剂、生物材料或特异性抗血清；或指用于定定或疾病诊断的生物试剂、生物材料或特异性抗血清；或指用于定量检测某些制品的生物效价的参考量检测某些制品的生物效价的参考物质，物质，其效价以特
36、定活性单位表其效价以特定活性单位表示，示，不不以以国际单位国际单位表示表示。l 3.1.2生物制品标准物质生物制品标准物质标准物质的标准物质的制备制备和和标定标定l国家标准品由国家标准品由中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所（下称检定（下称检定所）负责制备（或委托其他单位制备）、检定、初所）负责制备（或委托其他单位制备）、检定、初步标定、组织协作标定及供应。步标定、组织协作标定及供应。l国际标准品、参考品及参考试剂由检定所向国际标准品、参考品及参考试剂由检定所向WHO联系索取、保管和使用。联系索取、保管和使用。l新新建标准物质的研制建标准物质的研制l标准物质替换批的制备和标定标准物质替
37、换批的制备和标定新建标准物质的研制新建标准物质的研制：v原原材材料选择料选择v标准标准物质物质的的配制、配制、分装分装、冻干和熔封冻干和熔封v标定标定v协作标定协作标定v活性值的确定活性值的确定v稳定性研究稳定性研究v标准品的审定标准品的审定v保存与效期保存与效期3.1 生物制品的标准化l3.1.2 生物制品标准物质生物制品标准物质标准物质的审批标准物质的审批l检定所组织检定检定所组织检定l卫生部生物制品标准化委员会审查卫生部生物制品标准化委员会审查l卫生部审批卫生部审批l发放比准证书发放比准证书标签及说明书标签及说明书标准物质的索取与保管标准物质的索取与保管1.3 实验动物实验动物实验动物实
38、验动物是指来源清楚或遗传背景明确，符合微生物控制是指来源清楚或遗传背景明确，符合微生物控制指标要求，用于生物制品生产、检定及科研的动物。指标要求，用于生物制品生产、检定及科研的动物。l实验动物设施：实验动物设施：选址、建筑要求、区域划分、环境条选址、建筑要求、区域划分、环境条件件l实验动物的饲养管理实验动物的饲养管理l实验动物的供应和使用实验动物的供应和使用l实验动物的检疫和传染病的控制实验动物的检疫和传染病的控制l实验动物工作人员实验动物工作人员1.3 实验动物实验动物常用的几种实验动物常用的几种实验动物l小鼠小鼠l金黄地鼠金黄地鼠l豚鼠豚鼠l家兔家兔l猕猴猕猴2 生物制品的质量检定l2.1
39、 生物制品的理化检定生物制品的理化检定l2.2 生物制品的安全检定生物制品的安全检定l2.3 生物制品的效力检定生物制品的效力检定2.1 生物制品的理化检定生物制品的理化检定参照参照生物制品化学检定规程生物制品化学检定规程物理性状检查物理性状检查蛋白质含量测定蛋白质含量测定防腐剂含量测定防腐剂含量测定纯度检查纯度检查其它其它外观外观真空度及溶解时间真空度及溶解时间半微量定氮法半微量定氮法酚试剂法酚试剂法紫外吸收法紫外吸收法苯酚含量测定苯酚含量测定汞类防腐剂含量测定汞类防腐剂含量测定氯仿含量测定氯仿含量测定游离甲醛含量测定游离甲醛含量测定区带电泳区带电泳免疫电泳免疫电泳凝胶层析凝胶层析水份含量测
40、定水份含量测定氢氧化铝与磷酸铝含量测定氢氧化铝与磷酸铝含量测定磷含量测定磷含量测定O-乙酰基含量测定乙酰基含量测定2.2 生物制品的安全检定生物制品的安全检定一般安全性检查一般安全性检查杀菌、灭活和脱毒情况的检查杀菌、灭活和脱毒情况的检查外源性污染检查外源性污染检查过敏性物质检查过敏性物质检查2.2 生物制品的安全检定生物制品的安全检定 一般安全性检查一般安全性检查l 安全实验安全实验l 无菌实验无菌实验l 热源实验热源实验所用培养基所用培养基抽样抽样v本试验系将一定剂量的供试品静脉注入家兔，在规定期间本试验系将一定剂量的供试品静脉注入家兔，在规定期间内观察家兔体温升高情况，以判定供试品中所含
41、热原质的限内观察家兔体温升高情况，以判定供试品中所含热原质的限度是否符合规定的一种方法。度是否符合规定的一种方法。杀菌、灭活和脱毒情况的检查杀菌、灭活和脱毒情况的检查l 活毒检查活毒检查 灭活疫苗灭活疫苗l 解毒检查解毒检查 类毒素类毒素l 残余毒力实验残余毒力实验 活疫苗活疫苗 残余毒力和毒性物质检查 过敏性物质的检查2.3 生物制品的效力检定生物制品的效力检定 免疫力试验 活菌数和活病毒滴度测定 类毒素和抗毒素的单位测定 血清学实验 其他有关效力的检定和评价3 生物制品的分包装3.1 分装分装l分装前，检定合格，标签完整，明确。l防止错批，混批。l无菌操作，实际装量多于标签示量。3.2 包
42、装包装l破漏检查。l载名名称、批号、亚批号、有效期等。六 重要生物制品的制备（一）卡介疫苗生产工艺生产工艺l 分离的一株牛型结核杆菌，每分离的一株牛型结核杆菌，每23星期传代一次，星期传代一次，前后共传了前后共传了231代，经约代，经约13年时间，终于获得一株毒年时间，终于获得一株毒力稳定的减毒株力稳定的减毒株。l卡介苗制造大多采用表面培养，少数采用深层培养。卡介苗制造大多采用表面培养，少数采用深层培养。l（1）表面培养：表面培养：采用改良的苏通培养基；培养温度采用改良的苏通培养基；培养温度3739 ，培养时向，培养时向1012天，生产的卡介苗活力天，生产的卡介苗活力高，用高，用68天更幼龄的
43、培养有利于制备冻干制品，采天更幼龄的培养有利于制备冻干制品，采用对数生长期的幼龄培养菌代替平衡期培养菌生产，用对数生长期的幼龄培养菌代替平衡期培养菌生产，可使活菌率由可使活菌率由10左右提高至左右提高至3050。菌膜收集。菌膜收集后压平，移入盛有不锈钢珠瓶内，加入适量稀释液，后压平，移入盛有不锈钢珠瓶内，加入适量稀释液，低温下研磨，研磨好的原液稀释成各种浓度的菌苗。低温下研磨，研磨好的原液稀释成各种浓度的菌苗。l（2）深层培养）深层培养培养基：天冬酰胺0.5，柠檬酸镁1.5g，磷酸二氢钾5g 硫酸钾0.5g，吐温-80 0.5ml，葡萄糖锌10g种子培养：将原代菌种转接2次于上述培养基中37度
44、培养7d深层培养：将种子液转接到装有6L培养基的8L双臂瓶中，于 37度培养79d，通气搅拌培养；超滤除菌，加入 等量25乳糖水溶液混匀，分装，冻干，-70度 下保存。l（二）白喉类毒素（二）白喉类毒素l 白喉类毒素是一种用于预防白喉病的自动免疫制剂，是白喉类毒素是一种用于预防白喉病的自动免疫制剂，是由产毒力高的白喉棒状杆菌培养，滤液经福尔马林脱毒后精制由产毒力高的白喉棒状杆菌培养，滤液经福尔马林脱毒后精制（或精制后脱毒）而成，通常是制成吸附制剂或与其他预防制（或精制后脱毒）而成，通常是制成吸附制剂或与其他预防制剂配成混合制剂使用。剂配成混合制剂使用。l3、脱毒、脱毒l 白喉类毒素经脱毒即成为
45、无毒、但仍保持高度抗白喉类毒素经脱毒即成为无毒、但仍保持高度抗原性的类毒素。原性的类毒素。l 影响脱毒的主要因素有温度影响脱毒的主要因素有温度 温度越高脱毒越温度越高脱毒越快，且脱毒越完善，但超过快，且脱毒越完善，但超过40对抗原性有很大破坏，对抗原性有很大破坏，一般多采用一般多采用3739。pH pH越高脱毒越快，但越高脱毒越快，但碱性过强对抗原性有很大破坏，故碱性过强对抗原性有很大破坏，故PH在在7.07.5较为较为适宜。甲醛浓度适宜。甲醛浓度 甲醛浓度越高脱毒越快，但甲醛甲醛浓度越高脱毒越快，但甲醛浓度过高时脱毒后残余甲酸量过高，对抗原性有损害，浓度过高时脱毒后残余甲酸量过高，对抗原性有
46、损害，并会引起注射时的强烈刺痛。含氮量并会引起注射时的强烈刺痛。含氮量 毒素含氮量毒素含氮量越高脱毒时所需甲醛量越大，按毒素氨基氮含量加适越高脱毒时所需甲醛量越大，按毒素氨基氮含量加适量甲醛脱毒，既能脱毒完善，又避免过多的残余甲醛量甲醛脱毒，既能脱毒完善，又避免过多的残余甲醛量损坏抗原性。量损坏抗原性。（三）乙型肝炎疫苗的制备l 乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）属嗜肝属嗜肝DNA病病毒科（毒科（hepadnaviridae）。）。l HBV的发现源于表面抗原的研究。的发现源于表面抗原的研究。1963年年Blumberg首先在澳大利亚土著人血清中发现一种新
47、抗原，称为澳大首先在澳大利亚土著人血清中发现一种新抗原，称为澳大利亚抗原（利亚抗原（Australia antigen）；直至）；直至1968年确定这种年确定这种抗原与血清型肝炎密切相关，称为肝炎相关抗原抗原与血清型肝炎密切相关，称为肝炎相关抗原（hepatitis associated antigen，HAA）；）；1970年年D.S.Dane在肝炎患者血清中发现具有传染性的颗粒，即在肝炎患者血清中发现具有传染性的颗粒，即Dane颗粒（颗粒（Danes particle）。从而）。从而HBV被确认。被确认。l HBV是是乙型肝炎乙型肝炎病原体，主要经输血、注射、性行为病原体，主要经输血、注射
48、、性行为和母婴传播。起病徐缓，部分患者可转为慢性，少数还可和母婴传播。起病徐缓，部分患者可转为慢性，少数还可导致肝硬化和肝癌。导致肝硬化和肝癌。乙肝病毒发病区域l 全世界约有20亿人感染了该病毒，约有3.5亿人患有慢性感染。估计每年有60万人死于急性或慢性乙型肝炎。l 中国6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人长期携带乙肝病毒，据专家估计，目前全国有现患慢性乙肝病人3,000万人，高发地区为西北两省(甘肃、青海),年平均发病率为213.49/10万218.41/10万。中发地区为西部6省市(宁夏、新疆、内蒙古、重庆、四川、陕西),中部4省市(河南、山西、湖北、海南),以及东部2省市(广东、
49、福建),年平均发病率为88.19/10万153.30/10万。低发地区主要为东部省市(北京、天津、河北、黑龙江、辽宁、吉林、上海、江苏、安徽、山东),年平均发病率为25.41/10万84.21/10万。l 广西发病率排在全国第5位。乙型肝炎病毒形态与结构形态与结构 完整的完整的HBV颗粒亦称颗粒亦称Dane颗粒，直径为颗粒，直径为42nm，具有双层核壳结构：具有双层核壳结构：核心颗粒核心颗粒：直径为：直径为28nm。颗粒内部：颗粒内部：DNA和和DNA多聚酶多聚酶。颗粒表面（内衣壳）：含颗粒表面（内衣壳）：含有有HBcAg 和和HBeAg。外壳（包膜）外壳（包膜）：厚：厚7nm。脂质双层：含有
50、脂质双层：含有HBsAg、PHSAr 和和PreSAg蛋白质蛋白质HBV感染血清标志及其临床意义感染血清标志及其临床意义HBsAgHBeAg抗抗HBc 抗抗HBe抗抗HBs结结 果果 解解 释释IgMIgG-+感染过感染过HBV或接种过乙肝疫苗或接种过乙肝疫苗,有免疫力有免疫力+-/+-肝功正常为无症状携带者肝功正常为无症状携带者;肝功肝功异常为正患乙肝异常为正患乙肝;+-+-（小三阳）正患乙肝（小三阳）正患乙肝,肝炎趋向肝炎趋向好转，有传染性好转，有传染性+/-+-正患肝炎正患肝炎,或趋于恢复，有传染或趋于恢复，有传染性性+/-（大三阳）正患乙肝（大三阳）正患乙肝,病毒复制病毒复制,传染性强
