1、生物化学与分子生物学实验技术生物化学与分子生物学实验技术Experimental technology of Biochemistry and molecular biology生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学实验技术生物化学与分子生物学实验技术理论考试理论考试（60分）分）实验成绩实验成绩（40分）分）理论课理论课：3学时学时 3次次实验课实验课:6学时学时 6次次操作考试操作考试：3学时学时学时学时考试考试3.5学分学分2.5学分学分生物化学与分子生物学实验技术生物化学与分子生物学实验技术成绩分布成绩分布理论考试（理论考试（60分）分）：选择题（15题，15分）
2、判断题（15题，15分）填空题（15个空，15分）论述题（1题，15分）实验成绩（实验成绩（40分）分）:实验操作考试（10分）实验报告（15分）实验讨论（10分）考勤和卫生（5分）The basic experimental technology：一、分光光度技术一、分光光度技术二、层析技术二、层析技术 三、电泳技术三、电泳技术四、离心分析技术四、离心分析技术 五、五、PCR技术技术六、蛋白分离和纯化技术六、蛋白分离和纯化技术 一、分光光度技术一、分光光度技术(Spectrophotometry)n722型分光光度计的旋钮上标示的型分光光度计的旋钮上标示的0、100、A、T分别表示什么意思？
3、分别表示什么意思？n分光光度法检测物质浓度时为什么要用空白液？分光光度法检测物质浓度时为什么要用空白液？n将两个空比色杯放入分光光度计，以一个比色将两个空比色杯放入分光光度计，以一个比色杯作为对照，测另一个比色杯的吸光度。杯作为对照，测另一个比色杯的吸光度。Contents：一一)光的概述光的概述二二)分光光度法的概念及原理分光光度法的概念及原理四四)测定物含量的计算测定物含量的计算三三)分光光度计的构造及使用方法分光光度计的构造及使用方法一一)光的概述（光的概述（lightwave）1.1.光的性质光的性质u光是电磁波，通常用光是电磁波，通常用波长、频率波长、频率来描述不同的光波。来描述不同
4、的光波。波速波速=波长波长频率频率 不同波长不同波长(或不同频率或不同频率)的电磁波的电磁波在相同介质中在相同介质中的的传播速度传播速度都相同，电磁波的频率愈高，波长越短。都相同，电磁波的频率愈高，波长越短。一定波长的光具有一定的能量，波长越长（频一定波长的光具有一定的能量，波长越长（频率越低），光量子的能量越低；反之，波长越短率越低），光量子的能量越低；反之，波长越短（频率越高），光量子的能量越高。（频率越高），光量子的能量越高。溶液的颜色与吸收光颜色的关系溶液的颜色与吸收光颜色的关系 紫外光：紫外光：400nm 可见光可见光：400760nm 红外光：红外光：760nm 另根据电磁波的波长
5、不同又分为三个波段：另根据电磁波的波长不同又分为三个波段：可见光：可见光：电磁波谱中人眼可以感知的部分，波长在电磁波谱中人眼可以感知的部分，波长在400400到到760760纳米之间纳米之间 ，往往是具有颜色的光。，往往是具有颜色的光。实验证明：白光实验证明：白光(日光、白炽电灯光、日光灯光日光、白炽电灯光、日光灯光等等)就就是由以上不同颜色的光按一定的强度比例混合而成的。是由以上不同颜色的光按一定的强度比例混合而成的。白光叫做白光叫做复合光复合光；只具有一种颜色的光只具有一种颜色的光/同一波长的光叫做同一波长的光叫做单色光单色光。溶液的颜色与吸收光颜色的关系溶液的颜色与吸收光颜色的关系 为什
6、么以上多种有颜色的单色光混合在一起即变为白光？为什么以上多种有颜色的单色光混合在一起即变为白光？互补光互补光（complementary colors）：）：把适当颜色的把适当颜色的两种光两种光按一定强度比例混合能成为按一定强度比例混合能成为白光，这两种颜色的光称为互补光白光，这两种颜色的光称为互补光。2.2.介质对光波的吸收介质对光波的吸收u光在介质内传播时，介质中的束缚电子在光波电场作用下做光在介质内传播时，介质中的束缚电子在光波电场作用下做受迫振动，光波要消耗能量激发电子的振动，导致介质中的分受迫振动，光波要消耗能量激发电子的振动，导致介质中的分子（或离子）由基态跃迁到高能级的激发态。子
7、（或离子）由基态跃迁到高能级的激发态。u光的吸收光的吸收：是指原子在光照下，会吸收光子的能量由：是指原子在光照下，会吸收光子的能量由低能低能态态跃迁到跃迁到高能态高能态的现象。的现象。只要是介质，就会吸收各种光波？只要是介质，就会吸收各种光波？u介质吸收光的条件：介质吸收光的条件：而物质的基态和激发态是由物质的原子构成和原子间相而物质的基态和激发态是由物质的原子构成和原子间相互作用决定的，互作用决定的，不同物质不同物质由于其分子结构不同，导致物质能由于其分子结构不同，导致物质能态的不同，态的不同，对光的选择性吸收也就不一样对光的选择性吸收也就不一样。入射光的能量入射光的能量=介质中物质的介质中
8、物质的基态和激发态能量差基态和激发态能量差溶液的颜色与吸收光颜色的关系溶液的颜色与吸收光颜色的关系白光白光(红、青；红、青；橙、青蓝；橙、青蓝；黄、蓝；黄、蓝；绿、紫；绿、紫；)物质吸收光能的多少与什么有关系？物质吸收光能的多少与什么有关系？用眼睛观察、比较溶液颜色深度以用眼睛观察、比较溶液颜色深度以大致估计大致估计物质含量的物质含量的方法称为方法称为目视比色法目视比色法。利用物质能吸收光能的原理以利用物质能吸收光能的原理以精确测定精确测定物质含量的方法物质含量的方法分光光度法分光光度法Cu2二二)分光光度法的概念及原理分光光度法的概念及原理1.分光光度法的概念分光光度法的概念 当光线通过透明
9、溶液介质时，其辐射能量有部当光线通过透明溶液介质时，其辐射能量有部分被吸收而部分被透过，所以光线射出溶液介质分被吸收而部分被透过，所以光线射出溶液介质后后光能被减少光能被减少。这种利用。这种利用光能的吸收和透过比例光能的吸收和透过比例来进行某些物质的来进行某些物质的定性定量定性定量分析。分析。1.1.灵敏度高灵敏度高 分光光度法测定物质的浓度下限分光光度法测定物质的浓度下限(最低浓度最低浓度)一般可一般可达达1-10-3%的微量组分。的微量组分。2.分光光度法的特点分光光度法的特点2.2.准确度较高准确度较高 一般分光光度法的一般分光光度法的相对误差为相对误差为2-5%2-5%。3.3.操作简
10、便，测定速度快操作简便，测定速度快4.4.应用广泛应用广泛 几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用分光光度法进行测定。用分光光度法进行测定。入射光入射光 I0 吸收吸收Ia 透射透射It I0=Ia+It+Ir I0=Ia+It1.透光率透光率(T)和吸光度和吸光度(A)3.分光光度法的原理分光光度法的原理透光率透光率(transmittance)T=It/I0 吸光度吸光度(absorbance)T-=lgt0lgII=A2.Lambert-Beer定律定律（1）Lambert定律定律:（2）Beer定律定律:（3）Lambert-Be
11、er定律定律:K为吸光系数，对于一定物质的溶液为吸光系数，对于一定物质的溶液K为常数。为常数。A=KLA=KCA=KCLtC一定一定,ALL 一定一定,Ac三三)分光光度计的构造及使用分光光度计的构造及使用 能从含有各种波长的能从含有各种波长的混合光混合光中将每一中将每一单色光单色光分离出来并分离出来并测量其强度测量其强度的仪器称为分光光度计。的仪器称为分光光度计。紫外光紫外光分光光度计分光光度计 可见光可见光分光光度计分光光度计 红外光红外光分光光度计分光光度计 万用万用（全波段）分光光度计（全波段）分光光度计透射光能透射光能722型（触摸键式）型（触摸键式）722型（旋钮式）型（旋钮式）可
12、见光分光光度计：可见光分光光度计：722型（触摸键式）型（触摸键式）1.开电，预热开电，预热20分钟；分钟；2.调调“”选择所需波长选择所需波长波长旋钮波长旋钮 原理：将原理：将复合光复合光色散为不同色散为不同波长的波长的单色光单色光，然后再让所，然后再让所需波长的光通过一个很窄的需波长的光通过一个很窄的狭缝狭缝照射到照射到吸收池吸收池上。上。透射光能透射光能光路光路722型（触摸键式）型（触摸键式）1.开电，预热开电，预热20分钟；分钟；2.调调“”选择所需波长选择所需波长3.装液（装液（2/3）透射光能透射光能吸收池：比色皿吸收池：比色皿 用于盛放溶液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学用
13、于盛放溶液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为0.5 cm，1 cm，2 cm，3 cm和和5 cm。可见光可见光分光光度计分光光度计玻璃玻璃比色皿比色皿紫外光紫外光分光光度计分光光度计石英石英比色皿比色皿检测器：检测器：检测器的作用是接受从比色皿发出的检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光透射光并转换成并转换成电信号电信号进行测量。进行测量。光能光能 电能电能透射光能透射光能透射光能透射光能显示装置：显示装置：把放大的信号以吸光度把放大的信号以吸光度A或透光率或透光率T的方式显示或的方式显示或
14、记录下来。记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字数字显示记录仪显示记录仪。透射光能透射光能吸收池：比色皿吸收池：比色皿 用于盛放溶液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学用于盛放溶液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为0.5 cm，1 cm，2 cm，3 cm和和5 cm。可见光可见光分光光度计分光光度计玻璃玻璃比色皿比色皿紫外光紫外光分光光度计分光光度计石英石英比色皿比色皿722型（触摸键式）型（触摸键式）1.开电，预热开电，预热20分
15、钟；分钟；2.调调“”选择所需波长选择所需波长3.装液（装液（2/3）4.功能键置功能键置“T”调调“T”为为0（遮光体遮光体对对准光缝）准光缝）功能键功能键722型（触摸键式）型（触摸键式）1.1.开电，预热开电，预热2020分钟；分钟；2.2.调调“”选择所需波长选择所需波长3.3.装液（装液（2/32/3）4.4.功能键置功能键置“T”T”调调“T”T”为为0 0（遮光体遮光体对准光缝）对准光缝）5.5.功能键置功能键置“T”T”调调“T”T”为为100100（空白管空白管对准光缝）对准光缝）6.6.功能键置功能键置“A”A”依次拉动拉杆（听到依次拉动拉杆（听到“咔咔”一声）比一声）比色
16、、读数并记录（色、读数并记录（A A值取三位有效数值）值取三位有效数值）7.洗涤比色皿洗涤比色皿功能键功能键722分光光度计使用注意事项：分光光度计使用注意事项：1.样品室盖应样品室盖应轻开轻放轻开轻放；2.比色皿拿比色皿拿磨砂面磨砂面，液体装入约，液体装入约2/3高度高度，并，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗干净，倒置于滤纸上；干净，倒置于滤纸上；3.倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器仪器上请勿放任何物品上请勿放任何物品；四）测定物含量的计算四）测定物含量的计算标准管法标准管法标准曲线法标准曲线法1.标准管法
17、标准管法空白管(B)标准管(S)测定管(U)1/20稀释血清标本（ml）1.01/20稀释标准血清（ml）1.0生理盐水（ml）1.0双缩脲试剂（ml）4.04.04.0参比（空白）溶液参比（空白）溶液 blank：参比溶液的作用：扣除一切不来源于目标产物的光吸收。参比溶液的作用：扣除一切不来源于目标产物的光吸收。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。Standard sample Unknown sample 1.标准管法标准管法空白管(B)标准管(S)测定管(U)1/20稀释血清标本（ml）1.01/20稀释标准血清（ml）1.0生理盐水（ml
18、）1.0双缩脲试剂（ml）4.04.04.0As=Ks Cs LsAu=Ku.Cu.LuAs Ks Cs LsAu Ku.Cu.Lu=As.Cs.Au Cu.=2.标准曲线法标准曲线法试管试管1 12 23 34 45 5浓度（浓度（C=g/mlC=g/ml）10102020303040405050吸光度（吸光度（A A）0.0710.0710.1550.1550.2230.2230.2720.2720.3660.366将将AU=0.186代入公式代入公式y=139.6x-0.647求得求得CU=25.3g/mly=139.69x-0.6473R2=0.9876010203040506000.
19、10.20.30.4二、层析技术二、层析技术Chromatography TechniqueContents:一一)层析技术的概念层析技术的概念二二)层析技术的原理层析技术的原理三三)层析技术的分类层析技术的分类四四)凝胶层析技术凝胶层析技术一）层析技术的概念一）层析技术的概念n利用混合物中各组分的利用混合物中各组分的物理化学性质物理化学性质差异，使差异，使各组分在层析系统中以各组分在层析系统中以不同速度不同速度移动而达到分移动而达到分离的一种离的一种物理分离方法物理分离方法。混合物混合物A B C D二）层析技术的原理二）层析技术的原理理化性质：理化性质：吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子
20、极性、吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数分子亲和力以及分配系数。利用混合物中各组分利用混合物中各组分理化性质理化性质差异进行分离差异进行分离;固定相固定相流动相流动相固定不动（固定不动（液液/固固）针对固定相针对固定相（相对运动相对运动）（气）（气/液）液）推动样品中各组分通过固定相向前移动推动样品中各组分通过固定相向前移动层析系统层析系统n当待分离的混合物随流动相通过固定相时，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力相互作用（吸附、溶解、结合等）的能
21、力不同不同，在两相中进行，在两相中进行再分配再分配。n分部收集流出液，可得到样品中所含的各单分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。一组分，从而达到将各组分分离的目的。（1 1）按两相所处的状态分类：）按两相所处的状态分类：三）层析技术的分类三）层析技术的分类液相色谱液相色谱 气相色谱气相色谱 固定相固定相流动相流动相固定不动（固定不动（液液/固固）针对固定相针对固定相（相对运动相对运动）（气）（气/液）液）层析系统层析系统液液-固层析固层析液液-液层析液层析气气-固层析固层析气气-液层析液层析高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)柱层析柱层析纸层析纸层析薄层层
22、析薄层层析（2 2）按操作形式不同分类：）按操作形式不同分类：吸附层析：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分利用吸附剂表面对不同组分吸附性能吸附性能的的 差异，达到分离鉴定的目的。差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的利用不同组分在流动相和固定相之间的 分配系数分配系数（或溶解度）（或溶解度）不同，使之分离。不同，使之分离。离子交换层析：离子交换层析：利用不同组分对利用不同组分对离子交换剂亲和力离子交换剂亲和力的的 不同。不同。凝胶层析：凝胶层析：利用某些凝胶对于不同利用某些凝胶对于不同分子大小分子大小的组分阻的组分阻 滞作用的不同。滞作用的不同。（3
23、3）按层析原理分类：）按层析原理分类：四）凝胶层析技术四）凝胶层析技术 优点：优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等。实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等。因此凝胶层析技术广泛用于蛋白质（包括酶）、因此凝胶层析技术广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的核酸、多糖等生物分子的分离纯化分离纯化，同时还应用于，同时还应用于蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。、脱盐、样品浓缩等。凝胶层析：凝胶层析：凝胶颗粒多孔板凝胶（凝胶（琼脂糖琼脂糖/葡聚糖葡聚糖/聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺）液体液体（洗脱液
24、）（洗脱液）固定相固定相流动相流动相多聚葡萄糖多聚葡萄糖与与环氧丙烷环氧丙烷交联交联原理：原理：混合物中各组分按其混合物中各组分按其分分子颗粒大小不同子颗粒大小不同而被分而被分离的技术。离的技术。凝胶层析又称凝胶层析又称分子筛层析分子筛层析分离鉴定不同分子量大小的蛋白质用什么方法？分离鉴定不同分子量大小的蛋白质用什么方法？影响凝胶层析效果的因素：影响凝胶层析效果的因素：1 1层析柱的选择层析柱的选择 层析柱大小层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的一般来讲，主要是层析柱的长度长度对分辨率影响较对
25、分辨率影响较大，大，长的层析柱分辨率要比短的高长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。的一些困难。层析柱的直径和长度比一般在1：251：100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。品 名干胶颗粒直径/m得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量Da线性葡聚糖分子质量/Da20lOOSephadex G-1O40-1201.00.12-3700700319810
26、(100)Sephadex G-1540-1201.50.22.5-3.515001500319810(100)Sephadex G-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.50.24-61000-5000100-5000629810(100)Sephadex G-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.00.39-111500-30000500-10000629810(100)Sephadex G-75中粗超细40-12010-407.50.512-153000-700001000-500002434905(50)Sephdex G-100
27、中粗超细40-12010-4010l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)Sephadex G-150中粗超细40-12010-40151.520-305000-4000001000-1500007251472(15)Sephadex G-200中粗超细40-12010-40202.030-405000-8000001000-200000725981(10)2.凝胶的选择：凝胶的选择：3.3.装柱装柱不能有气泡！不能有气泡！加样量对实验结果也可能造成较大的影响：加样量对实验结果也可能造成较大的影响：加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过多，
28、会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。另外加样前要注意：样品中有不溶物必须在上样前去掉，以另外加样前要注意：样品中有不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品黏度不能过大，否则会影响分离效果。免污染凝胶柱。样品黏度不能过大，否则会影响分离效果。4.4.加
29、样量加样量5.5.洗脱速度洗脱速度 洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。速度要恒定而且合适。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散。但洗脱速度过慢会造成样品扩散。一般凝胶的流速是一般凝胶的流速是2 210 ml10 mlh h，市售的凝胶一般会，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。提供一个
30、建议流速，可供参考。总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。都要根据具体的实验要求来选择。凝胶层析的应用范围：凝胶层析的应用范围：n凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。n分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。n利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。凝胶层析的优点凝胶层析的优点:n凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。n目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作 有一次实验操作练习！有一次实验操作练习！
