1、分离特定的微生物并测定其数量 用液体培养基分离、培养用液体培养基分离、培养 用固体培养基分离、培养用固体培养基分离、培养 二元培养物分离、培养二元培养物分离、培养 选择培养分离选择培养分离 单孢子分离单孢子分离微生物分离方法微生物分离方法要分离微生物，必须根据它的特点，包括营养、生要分离微生物，必须根据它的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法，经过一定理、生长条件等，采用选择培养的方法，经过一定时间的培养后，使这种微生物在群落中的数量不断时间的培养后，使这种微生物在群落中的数量不断增加，在通过平板稀释法等进行纯培养增加，在通过平板稀释法等进行纯培养分离。分离。微生物纯种分离微生
2、物纯种分离 将多种混杂微生物，经某种技术或方法分离成纯种将多种混杂微生物，经某种技术或方法分离成纯种的过程的过程纯培养（纯培养（pure culture）在适宜条件下培养纯种获得的在适宜条件下培养纯种获得的培养物培养物（群体）群体）l单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，子细胞群体，称为菌落称为菌落(colony)。菌落菌落一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养；一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养；单个微生物只在固体培养基上形成菌落；单个
3、微生物只在固体培养基上形成菌落；在液体培养基中不会形成菌落在液体培养基中不会形成菌落同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落 菌落形态包括菌落的菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等地、颜色和透明程度等。每一种细菌在一定条件下。每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。不同种或同种在不同的培养形成固定的菌落特征。不同种或同种在不同的培养条件下，菌落特征是不同的。这些特征对菌种识别、条件下，菌落特征是不同的。这些特征对菌种识别、鉴定有一定意义。鉴定有一定意义。微生物样品微生物样品多种混杂多种混杂某
4、种方法某种方法分散成单个微生物分散成单个微生物平板平板培养培养单菌落单菌落每个菌落为纯种（纯培养）每个菌落为纯种（纯培养）单菌落转接培养单菌落转接培养纯种（纯培养）纯种（纯培养）微生物纯种分离的原理和方法微生物纯种分离的原理和方法一、一、用用固体培养基（营养琼脂平板）分离纯种固体培养基（营养琼脂平板）分离纯种平板分离法：将单个微生物分离和固定在固体培养平板分离法：将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成单个菌落繁殖均可形成单个菌落微生物微生物接种方法常见的接种方法常见的有有：平板划线平板划线法法和和稀释
5、涂布平板法。稀释涂布平板法。1.平板划线法平板划线法通过通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法将将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。单个细胞，从而能在培
6、养基表面形成单个的菌落。稀释稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。涂布平板操作。纯种纯种平板分离的不同方法平板分离的不同方法从土壤中分离纯微生物从土壤中分离纯微生物104/ml103/ml102/ml101/ml涂布平板法涂布平板法稀释倒平板法稀释倒平板法1、涂布平板法（、涂布平板法（spread plate method)2、稀释倒平板法（倾注平板法）（、稀释倒平板法（倾注平板法）（pour plate method)分区划线法（蛇形线法）操作图分区划线法（蛇形线法）操作图第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划
7、线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环3、平板划线法（、平板划线法（streak plate method）分区划线法适用范围：分区划线法适用范围：适用于适用于浓度较大的样品浓度较大的样品连续划线法操作图连续划线法操作图连续连续划线法适用范围：划线法适用范围：适用于适用于浓度较小的样品浓度较小的样品二、选择培养分离二、选择培养分离 创造适于目的微生物生长条件创造适于目的微生物生长条件原理原理：促使目的微生物快速生长呈优势菌促使目的微生物快速生长呈优势菌 抑制抑制非目的微生物生长非目的微生物生长 从混杂微生物中分离目的微生物从混杂微生物中分离目的微生物利用利用选
8、择培养基进行直接分离选择培养基进行直接分离选择培养基选择培养基只只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其他允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的微生物生长的培养基培养基。选择培养基选择培养基加入加入青霉素青霉素的培养基的培养基:分离分离酵母菌、霉菌等真菌酵母菌、霉菌等真菌加入加入高浓度食盐高浓度食盐的培养基的培养基:分离分离金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌不加氮源不加氮源的无氮培养基的无氮培养基:分离分离固氮菌固氮菌不加含碳不加含碳有机物的无碳培养基有机物的无碳培养基:分离分离自养型微生物自养型微生物加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基:分离分离导
9、入了目的基因的受体细胞导入了目的基因的受体细胞可抑制细菌、可抑制细菌、放线菌细胞壁放线菌细胞壁主要成分肽聚主要成分肽聚糖的合成糖的合成其细胞壁是由纤其细胞壁是由纤维素、几丁质、维素、几丁质、葡聚糖葡聚糖组成组成1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸吸收。收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NH2)2脲酶脲酶+CO2NH3+H2O
10、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数原理：培养基的原理：培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。的微生物。（一）筛选菌株（一）筛选菌株15.0g琼脂琼脂1.0g尿素尿素10.0g葡萄糖葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH
11、2PO4土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？培养基？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素选择培养基选择培养基1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量计算一定容积里样品中微生物的数量缺点缺点：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数不适于对
12、运动细菌的计数（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目计数计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半，其上各刻有一个平台，中央平台又由一短槽隔成两半，其上各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数室。为计数用，称为计数室。*#血球计数板计数室有两种刻度血球计数板计数室有两种刻度1大格大格=16中格中格2516=400小格小格1大格大格=25中格中格16 25=400小格小格计算公式计算公式(1)16格格25格的血球计数板计算公式格的血球
13、计数板计算公式:酵母细胞数酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数/100400104稀释稀释倍数倍数(2)25格格x16格的血球计数板计算公式格的血球计数板计算公式:酵母细胞数酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数/80400104稀释倍数稀释倍数以计数酵母菌为以计数酵母菌为例例(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数个数(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格以每小方格内含有内含有4-5个酵母细胞为宜个酵母细胞为宜,一般稀释一般稀释10倍即倍即可可(3)将血球计数
14、板用擦镜纸擦净将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专在中央的计数室上加盖专用的厚玻用的厚玻片片(4)将稀释后的酵母菌悬液将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘边缘,使菌液缓缓渗入使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数使酵母菌全部沉降到血球计数室内室内血球计数板的使用血球计数板的使用(5)计数时计数时,如果使用如果使用16格格25格规格的计数室格规格的计数室,要按对角要按对角线位线位,取左上取左上,右上右上,左下左下,右下右下4个中格个中格(即即100个小格个小格)的酵的酵母菌数
15、母菌数.如果规格为如果规格为25格格16格的计数板格的计数板,除了取其除了取其4个对个对角方位外角方位外,还需再数中央的一个中格还需再数中央的一个中格(即即80个小方格个小方格)的酵的酵母菌母菌数数(6)当遇到位于大格线上的酵母菌当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的一般只计数大方格的上上方和方和右右方线上的酵母细胞方线上的酵母细胞(或只计数或只计数下下方和方和左左方线上方线上的酵母细胞的酵母细胞)(7)对每个样品计数三次对每个样品计数三次,取其平均值取其平均值,按下列公式计算每按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌菌液中所含的酵母菌个数个数（1）常用方法：）常用方法：通过统计平板上
16、的通过统计平板上的菌落数菌落数，就能推测出样品中，就能推测出样品中大约大约含有含有多少活菌。多少活菌。（2）原理：）原理：稀释涂布平板稀释涂布平板法法2.间接计数法间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）一一土壤土壤取样取样从从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。灭菌。二二制备培养基制备培养基制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。实验的具体操作实验的
17、具体操作 应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板三三样品的稀释样品的稀释四四取样取样涂布涂布实验时要对实验时要对培养皿作好标培养皿作好标记。注明培养记。注明培养基类型、培养基类型、培养时间、稀释度、时间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了2个或个或2个以上菌落数目在
18、个以上菌落数目在30300的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的的平板上进行计数。平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌
19、落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左个左右为最好。右为最好。五五结果结果分析与评价分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有30
20、300个菌落的稀释倍个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。精确。课课 题题 延延 伸伸 能分解尿素的细菌的鉴定能分解尿素的细菌的鉴定鉴定的原理：鉴定的原理：细菌细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的pH升高。升高。鉴定方法：鉴定方法：在在以尿素为唯一氮源的培养基中加入以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂酚红指示剂，利用此，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化。培养基进行细菌培
21、养，观察培养基的颜色变化。分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离（一）纤维素与纤维素酶（一）纤维素与纤维素酶纤维素纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。纤维素酶纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括：由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。解成葡萄糖。纤维素纤维素C1酶酶Cx酶酶纤维二糖纤维二糖葡萄糖葡萄糖苷苷 酶酶葡萄糖葡萄糖刚果红染色法
22、刚果红染色法刚果红刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。二糖和葡萄糖发生这种反应。用用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现以菌落为中心的养基中出现以菌落为中心的透明圈透明圈时，可说明该菌落是时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚纤维素分解菌，因为它已将被刚 果红果红 染成红色的纤维素染成红色的纤维素分解了。分解了。原理：原理：1产生标准菌落的细菌的最初数目和培养基产生标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是分别是()A一个细菌，液体培养基一个
23、细菌，液体培养基B许多细菌，液体培养基许多细菌，液体培养基C一个细菌，固体培养基一个细菌，固体培养基D许多细菌，固体培养基许多细菌，固体培养基C随堂练习随堂练习2有关涂布平板法的叙述错误的是有关涂布平板法的叙述错误的是()A首先将菌液进行一系列的梯度稀释首先将菌液进行一系列的梯度稀释B然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面培养基的表面C适宜条件下培养适宜条件下培养D结果都可在培养基表面形成单个的菌落结果都可在培养基表面形成单个的菌落D3选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基；含尿素基；含尿素(不含其他氮源不含其他氮源)的培养基，可从土壤中的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是分离出的微生物依次是()A硝化细菌、放线菌、根瘤菌硝化细菌、放线菌、根瘤菌B根瘤菌、青霉菌、固氮菌根瘤菌、青霉菌、固氮菌C异养型细菌、放线菌、硝化细菌异养型细菌、放线菌、硝化细菌D自养型细菌、固氮菌、分解尿素的细菌自养型细菌、固氮菌、分解尿素的细菌D谢谢观看
