1、31、效价高、疗效可靠、效价高、疗效可靠2、安全性好、不易产生副反应、安全性好、不易产生副反应3、稳定性好，便于保存和运输、稳定性好，便于保存和运输4、资源有限、研究意义重大、资源有限、研究意义重大41、血液制品、血液制品 l 血液制品是指由健康人的血浆或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分。用于治疗和被动免疫预防。l 血液制品属于治疗用生物制品。5血液制品血液制品 全血全血血液成分制品血液成分制品血浆蛋白制品血浆蛋白制品红细胞制剂红细胞制剂白细胞制剂白细胞制剂血小板制剂血小板制剂血浆制剂血浆制剂白蛋白类制品白蛋白类制品免疫球蛋白类制品免疫
2、球蛋白类制品等等62、尿液制品、尿液制品 人的尿液中含有许多重要的生理活性人的尿液中含有许多重要的生理活性物质。目前产品有尿激酶、激肽释放酶、物质。目前产品有尿激酶、激肽释放酶、尿抑胃素、人尿胰蛋白酶抑制剂、人绒毛尿抑胃素、人尿胰蛋白酶抑制剂、人绒毛膜促性腺激素（膜促性腺激素（HCG）等。）等。73、胎盘制品、胎盘制品 人胎盘制品主要有人胎盘丙种球蛋人胎盘制品主要有人胎盘丙种球蛋白、人胎盘白蛋白、人胎盘白、人胎盘白蛋白、人胎盘RNA酶抑制剂酶抑制剂等。等。84、人体液细胞中的活性物质、人体液细胞中的活性物质 人体液细胞包括红细胞、淋巴细胞、人体液细胞包括红细胞、淋巴细胞、血小板、成纤维细胞等。
3、这些细胞内的重血小板、成纤维细胞等。这些细胞内的重要物质，也就是细胞因子具有重要的生理要物质，也就是细胞因子具有重要的生理功能。功能。9(1).血液的组成：血液的组成：A.无形成份无形成份血浆血浆 5060%红细胞红细胞白细胞白细胞血小板血小板4050%B.有形成份有形成份1.血液的成分血液的成分11血浆蛋白的组成：血浆蛋白的组成：12（2）血液的功能：）血液的功能：A.输送氧气和二氧化碳，以进行肺与组织间的气体输送氧气和二氧化碳，以进行肺与组织间的气体交换；交换；B.维持渗透压维持渗透压，调节酸碱和电解质平衡；，调节酸碱和电解质平衡；C.运输养份和代谢产物，传递维生素、激素和药物；运输养份和
4、代谢产物，传递维生素、激素和药物；E.防御和免疫；防御和免疫；F.凝血和溶栓作用等。凝血和溶栓作用等。13（3）血容量血容量、休克、渗透压、白蛋白：、休克、渗透压、白蛋白：血容量血容量指全身有效循环血量而言。有效循环血量是指全身有效循环血量而言。有效循环血量是指单位时间内通过心血管系统进行循环的血量，而指单位时间内通过心血管系统进行循环的血量，而不包括贮存于肝、脾和淋巴血窦中或停滞于毛细血不包括贮存于肝、脾和淋巴血窦中或停滞于毛细血管中的血量。管中的血量。14休克：休克：在医学上是指由于多种原因引起的全身在医学上是指由于多种原因引起的全身微循环微循环障碍障碍导致的临床综合征。导致的临床综合征。
5、微循环微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环，是血是指微动脉和微静脉之间的血液循环，是血液与组织细胞进行物质交换的场所。液与组织细胞进行物质交换的场所。失血性休克、失血性休克、心原性休克、中毒性休克、心原性休克、中毒性休克、过敏性休克、神经原性休克过敏性休克、神经原性休克15162、输血疗法的发展、输血疗法的发展输血发展史的里程碑输血发展史的里程碑1628 Harvey 血液循环血液循环1901 Landsteiner 血型血型1914 Hustin 抗凝剂抗凝剂 1917 Robertson 17常用的抗凝剂常用的抗凝剂ACDCPD183、血液的综合利用、血液的综合利用全血的缺点：全血的缺点
6、：A.大量输全血可使循环超负荷。大量输全血可使循环超负荷。B.全血输入越多，患者的代谢负担越重。全血输入越多，患者的代谢负担越重。C.全血容易产生同种免疫，不良反应多。全血容易产生同种免疫，不良反应多。D.全血内所含的成分不浓、不纯和不足一个全血内所含的成分不浓、不纯和不足一个治疗剂量，疗效差。治疗剂量，疗效差。E.全血是宝贵的社会资源，盲目输注全血是全血是宝贵的社会资源，盲目输注全血是对血源的浪费。对血源的浪费。19全血适应证：全血适应证：A.全血可用于急性大量血液丢失可能出现低全血可用于急性大量血液丢失可能出现低血容量休克患者；血容量休克患者；B.存在持续活动性出血，估计失血量超过自存在持
7、续活动性出血，估计失血量超过自身血容量身血容量30%的患者（我国临床输血技术的患者（我国临床输血技术规范规定）。规范规定）。20成分输血：成分输血：把全血中的各种有效成分分离出来，把全血中的各种有效成分分离出来，分别制成高浓度的制品，然后根据不同分别制成高浓度的制品，然后根据不同患者的需要，输给相应制品。这是当前患者的需要，输给相应制品。这是当前输血技术发展的总趋势，也是输血现代输血技术发展的总趋势，也是输血现代化的重要标志之一。化的重要标志之一。21成分输血的优点：成分输血的优点：A.制剂容量小，浓度和纯度高，治疗效果好。制剂容量小，浓度和纯度高，治疗效果好。B.使用安全，不良反应少。使用安
8、全，不良反应少。C.减少输血传播疾病的发生。减少输血传播疾病的发生。E.便于保存，使用方便。便于保存，使用方便。F.综合利用，节约血液资源。综合利用，节约血液资源。22（1）、全血）、全血临床作用：临床作用：缺点：输血反应缺点：输血反应23（2）血液成分制品）血液成分制品 血液成分制品血液成分制品(blood components)专专指用物理的或机械的方法分离出来的血指用物理的或机械的方法分离出来的血液的一部分，如各种血细胞、血浆等，液的一部分，如各种血细胞、血浆等，是从单个或血型相同的供者血液中采集是从单个或血型相同的供者血液中采集的。的。24红细胞制剂红细胞制剂浓缩红细胞浓缩红细胞洗涤红
9、细胞洗涤红细胞添加液红细胞添加液红细胞去白细胞红细胞去白细胞红细胞冰冻红细胞冰冻红细胞25白细胞制剂白细胞制剂生理功能：生理功能：临床应用：临床应用：缺点：缺点：TA-GVHD。26血小板制剂血小板制剂常规浓缩血小板、单采浓缩血小板、照常规浓缩血小板、单采浓缩血小板、照射血小板射血小板生理功能：生理功能：临床应用：临床应用：缺点：人类白细胞抗原（缺点：人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）27血浆制剂血浆制剂血液制品管理条例血液制品管理条例原料血浆必须使用单采血浆机械采集原料血浆必须使用单采血浆机械采集28新鲜冷冻血浆（新鲜冷冻血浆（FFP）普通冷冻血浆普通冷
10、冻血浆(frozen plasma，FP)新鲜液体血浆新鲜液体血浆(fresh liquid plasma，FLP)等等29（3）血浆蛋白制品）血浆蛋白制品 血浆蛋白制品血浆蛋白制品(plasma products)是指从是指从人血浆中分离制备的有明确临床疗效和应人血浆中分离制备的有明确临床疗效和应用意义的蛋白制品的总称，国际上将这部用意义的蛋白制品的总称，国际上将这部分制品称为血浆衍生物分制品称为血浆衍生物(plasma derivatives)。30白蛋白类制品白蛋白类制品生理功能：生理功能：A.维持血液渗透压：维持血液渗透压：lg白蛋白声生的渗透白蛋白声生的渗透压相当于压相当于20ml液
11、体血浆或液体血浆或40ml全血。全血。B.抗休克作用：能增加血液的有效循环量，抗休克作用：能增加血液的有效循环量，对创伤、手术或烧伤所引起的休克有明显对创伤、手术或烧伤所引起的休克有明显疗效。疗效。31C.运输和解毒作用：白蛋白能结合阳离子，运输和解毒作用：白蛋白能结合阳离子，也能结合阴离子，故能输送性质不同的物也能结合阴离子，故能输送性质不同的物质，如脂肪酸、激素、金属离子、酶和药质，如脂肪酸、激素、金属离子、酶和药物，并能结合有毒物质，运送至解毒器官。物，并能结合有毒物质，运送至解毒器官。D.营养供给：组织蛋白和血浆蛋白可互相营养供给：组织蛋白和血浆蛋白可互相转化，白蛋白可作为机体内的氮源
12、，为组转化，白蛋白可作为机体内的氮源，为组织提供营养。织提供营养。32免疫球蛋白类制品免疫球蛋白类制品A.肌注免疫球蛋白制剂肌注免疫球蛋白制剂临床作用：临床作用：缺点：缺点：制造方法：制造方法：33B.静脉注射免疫球蛋白制剂（静脉注射免疫球蛋白制剂（Intravenous Immunoglobulin，IVIG）临床应用：临床应用：原发性和继发性免疫缺陷症原发性和继发性免疫缺陷症特发性血小板减少性紫癜特发性血小板减少性紫癜川崎病川崎病34C.特异性免疫球蛋白制剂特异性免疫球蛋白制剂 人乙型肝炎免疫球蛋白人乙型肝炎免疫球蛋白等等35凝血系统蛋白制品凝血系统蛋白制品 我国现在能作的只有少数几种：我
13、国现在能作的只有少数几种：凝血因子凝血因子VIII凝血酶原复合物凝血酶原复合物纤维蛋白原制剂等。纤维蛋白原制剂等。36血浆相关病毒的概念血浆相关病毒的概念原料血浆筛查及检疫期管理原料血浆筛查及检疫期管理血液制品生产工艺去除病毒能力血液制品生产工艺去除病毒能力血液制品病毒灭活血液制品病毒灭活/去除工艺去除工艺保证血液制品病毒安全性的其他措施保证血液制品病毒安全性的其他措施原料血浆的特殊性原料血浆的特殊性具有潜在的病毒风险，若获得起始原材料的过程具有潜在的病毒风险，若获得起始原材料的过程和生产过程控制不严密，可能导致血源性传染病和生产过程控制不严密，可能导致血源性传染病感染：感染：p甲型肝炎病毒（
14、甲型肝炎病毒（HAV）p乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）p丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV）p丁型肝炎病毒（丁型肝炎病毒（HDV）p艾滋病病毒（艾滋病病毒（HIV）p巨细胞病毒（巨细胞病毒（CMV）p人类细小病毒（人类细小病毒（HPV）p朊病毒（朊病毒（CJDV）p其他可通过血液传播的病毒其他可通过血液传播的病毒病毒名称病毒名称大小大小（nm）病病 毒毒 包包 膜膜核核 酸酸传传 播播 介介 质质全全 血血血液制品血液制品乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）42 DNA 丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV）30-60 RNA 人类免疫缺陷病毒（人类免疫缺陷病毒（HIV）100RNA 人嗜
15、人嗜T淋巴细胞病毒淋巴细胞病毒（HTLV）90-140 RNA 巨细胞病毒（巨细胞病毒（CMV）200DNAEB病毒（病毒（EBV）150-180DNA甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAV）27-32 RNA 丁型肝炎病毒（丁型肝炎病毒（HDV）28-39 RNA 人细小病毒（人细小病毒（HPV）18-26 DNA 克雅氏病（克雅氏病（CJD）蛋白质源性的传染因子（朊蛋白蛋白质源性的传染因子（朊蛋白Prion Protein)埃博拉病毒（埃博拉病毒（Ebola）、西尼罗病毒（）、西尼罗病毒（West-nile）、）、SARS病毒、禽流感病毒？病毒、禽流感病毒？l血液制品是以人血浆为原料生产的。l
16、原料血浆来自单采血浆站采集的血浆。l单采血浆站由血液制品生产企业设置和管理，应遵守血液制品管理条例、单采血浆站基本标准、单采血浆站管理办法和单采血浆站质量管理规范等法律法规的相关规定。l血浆采集后，应在6小时内冻结，置l -20以下保存，保存期不超过3年。l血浆用专用冷藏车在-15 以下运输。l 用国家中检所检定合格的批批检试剂测定HBsAg、HIV抗体、HCV抗体、ALT、梅毒、血浆蛋白、抗-HBs等其他抗体含量。原料血浆血清学的检测：原料血浆血清学的检测：HBsAgHBsAg抗抗HCVHCV抗抗HIVHIVALTALT梅毒梅毒l 2008年6月31日后建立原料血浆投料前的“检疫期”制度.l
17、血浆采集复检合格后放置90天等献浆员第二次献浆检测合格后投产。减少窗口期传染。l若用NAT/PCR 检测，“窗口期”可由90天缩短至60天.三种病毒的窗口期平均天数三种病毒的窗口期平均天数 ELISA NATHCV 82 23 HIV 22 11 HBV 59 34 合格供浆员合格供浆员供浆员注册供浆员注册供血浆者档案查询供血浆者档案查询建立首次供浆者档案建立首次供浆者档案新供浆员新供浆员合格供浆员合格供浆员问询问询合格？合格？NO拒绝拒绝YES体检体检合格？合格？NOYES血清样本血清样本新供浆员新供浆员*血清检验血清检验合格？合格？NO新供浆员注册新供浆员注册YES*血浆采集血浆采集入浆站
18、血浆库房入浆站血浆库房血浆检测血浆检测合格供浆员合格供浆员合格？合格？YES拒绝拒绝NO运输至血液制品厂家运输至血液制品厂家*检测用试剂经国家批批检和入厂确认检测用试剂经国家批批检和入厂确认*采浆耗材经入厂检验合格采浆耗材经入厂检验合格YES验收验收合格？合格？NoSFDA监督下销毁监督下销毁血浆血浆样品样品血浆抽样血浆抽样YES保留样品库房保留样品库房待检区待检区*检测检测 血浆投产血浆投产2年后年后销毁销毁合格？合格？检疫期检疫期YESNO不合格不合格合格？合格？NO合格血浆合格血浆QA放行放行投浆生产投浆生产永久拒绝永久拒绝供血浆者淘汰供血浆者淘汰不合格血浆不合格血浆省级监督员监督销省级
19、监督员监督销毁毁/其他用途其他用途检测试剂检测试剂SFDA放行放行检测试剂使用前蓉生确检测试剂使用前蓉生确认认保留样品保留样品投浆生产投浆生产检疫期管理检疫期管理生产厂家复检生产厂家复检询问询问/体检体检/血浆采集血浆采集/筛查筛查 单采血浆站单采血浆站单采血浆站管理办法单采血浆站管理办法/浆站浆站GMP中国药典中国药典三部三部 中国药典中国药典三部三部 原料血浆检疫期指导原则原料血浆检疫期指导原则GMP冷链运输冷链运输Cohns低温乙醇血浆组分法低温乙醇血浆组分法低温乙醇沉淀低温乙醇沉淀法生产工艺中可去除一定量的病毒；法生产工艺中可去除一定量的病毒；过滤法过滤法包括用于包括用于IVIG的深层
20、过滤，经确证的深层过滤，经确证能大量除去脂包膜和非包膜病毒，模型病毒为能大量除去脂包膜和非包膜病毒，模型病毒为HBV、HIV、ParvovirusB19、HAV。工艺技术去病毒能力工艺技术去病毒能力白蛋白三步沉淀病毒白蛋白三步沉淀病毒Log减少数减少数StepEthand（%）PHLog Reduction FactHIV PRV Sindbis BEVStep A195.85 3.3 3.7 4.2 4.2Step 405.85 4.4 5.7 5.4 3.6Step D104.6 0.9 1.7 3.1 1.2工艺技术去病毒能力工艺技术去病毒能力IVIG三步沉淀病毒三步沉淀病毒Log减少数
21、减少数StepEthand（%）PHLog Reduction FactHIV PRV Sindbis BEVStep A195.854.0 3.6 3.2 3.4Step B125.155.3 4.7 4.6 4.1Step C257.04.0 4.7 2.9 3.8Step D2.2 3.0 1.7 2.8工艺技术去病毒能力工艺技术去病毒能力l血液制品安全控制血液制品安全控制l原料血浆安全控制原料血浆安全控制l-不同层次的病原体检测方法不同层次的病原体检测方法l-检疫期制度：排除潜在危险的血浆检疫期制度：排除潜在危险的血浆l病毒灭活病毒灭活/去除工艺及其效果验证去除工艺及其效果验证l生产与
22、质量管理：生产与质量管理：cGMPl质量标准与质量控制质量标准与质量控制l巴氏消毒法（巴氏消毒法（60/10h）l即在即在600.5连续加热连续加热10-11小时。小时。l白蛋白采用这个方法进行病毒灭活，通常是在除菌过滤、分白蛋白采用这个方法进行病毒灭活，通常是在除菌过滤、分装到最终容器以后进行加热处理。通常，为防止蛋白质变性，装到最终容器以后进行加热处理。通常，为防止蛋白质变性，在除菌过滤前要加入低浓度的辛酸钠或辛酸钠与在除菌过滤前要加入低浓度的辛酸钠或辛酸钠与N-乙酰色氨乙酰色氨酸作为保护剂。酸作为保护剂。l几十年的临床使用情况证明，采用低温乙醇法和巴氏灭活方几十年的临床使用情况证明，采用
23、低温乙醇法和巴氏灭活方法生产的白蛋白对肝炎病毒和法生产的白蛋白对肝炎病毒和HIV是安全的。是安全的。l冻干品加热法冻干品加热法l蛋白质冻干除去水分以后可以耐受蛋白质冻干除去水分以后可以耐受60-80或更高温度。在或更高温度。在80以上以上加热可以产生令人满意的对加热可以产生令人满意的对HBV、HCV、HIV和和HAV的病毒灭活效的病毒灭活效果。果。l冻干品加热法一般多用于凝血因子类产品。由于冻干后病毒也更稳定，冻干品加热法一般多用于凝血因子类产品。由于冻干后病毒也更稳定，因此，必须进行在规定条件下的病毒灭活验证。因此，必须进行在规定条件下的病毒灭活验证。l冻干品加热法的病毒灭活效果受产品的水分
24、残留量、组成成分如蛋白冻干品加热法的病毒灭活效果受产品的水分残留量、组成成分如蛋白质、糖、盐和氨基酸的含量以及冰冻与冻干时间的影响。质、糖、盐和氨基酸的含量以及冰冻与冻干时间的影响。l由于病毒灭活对水分残留量特别敏感，因此要根据验证结果设置允许由于病毒灭活对水分残留量特别敏感，因此要根据验证结果设置允许的水分残留限度，并保持瓶间残留水分的差异处于限度内。的水分残留限度，并保持瓶间残留水分的差异处于限度内。lS/D法法 TNBP(0.3%)/Cholate(0.2%)（30/6h）l TNBP(0.3%)/Tween-80(1%)（24/6h）l TNBP(0.3%)/Triton-100(1%
25、)（24/46h）l有机溶剂与去污剂的混合物（有机溶剂与去污剂的混合物（S/D）能够破坏）能够破坏包膜病毒的脂膜结构，导致受到破坏的病毒无包膜病毒的脂膜结构，导致受到破坏的病毒无法与感染细胞结合。但该方法不能灭活非脂包法与感染细胞结合。但该方法不能灭活非脂包膜病毒。膜病毒。l低低pH法法l 在某些酸性条件下在某些酸性条件下,脂包膜病毒可以被灭活。免脂包膜病毒可以被灭活。免疫球蛋白经低疫球蛋白经低pH如如pH4）处理，可以有效灭活几种脂）处理，可以有效灭活几种脂包膜病毒。如在免疫球蛋白生产中，通常采用包膜病毒。如在免疫球蛋白生产中，通常采用20-22，pH4.1培育培育21天。天。l 灭活条件如
26、灭活条件如pH值、孵放时间和温度、胃酶含量、值、孵放时间和温度、胃酶含量、蛋白质浓度、溶质含量等因素，可能影响灭活效果，蛋白质浓度、溶质含量等因素，可能影响灭活效果，应确定这些参数允许变化的幅度。应确定这些参数允许变化的幅度。lM MB在白色荧光在白色荧光45000lux照射小照射小时。时。lMB法已用于临床血浆的病毒灭活法已用于临床血浆的病毒灭活l补骨脂补骨脂S-59(150M)结合结合UVA(3J/cm2)l使用20nm或50nm的膜过滤。l 8、射线法l沉淀沉淀l层析（离子交换或亲和层析）层析（离子交换或亲和层析）l纳米膜过滤纳米膜过滤第二节第二节 人体来源生物制品制备实例人体来源生物制
27、品制备实例（Example of bio-preparation application to human）一、人血浆白蛋白制剂的制备（一、人血浆白蛋白制剂的制备（preparation of human blood plasma albumin）（1）结构和性质）结构和性质（structure and character）人血是一种红色混浊的、具有一定腥味与粘滞性的液体。用人血是一种红色混浊的、具有一定腥味与粘滞性的液体。用适当的抗凝剂除去其中的有形成分（如红血球）而得到淡黄色、适当的抗凝剂除去其中的有形成分（如红血球）而得到淡黄色、半透明的液体叫半透明的液体叫血浆血浆。血浆中除含有大量的水
28、分以外，还含有血浆血浆中除含有大量的水分以外，还含有血浆蛋白等溶质。蛋白等溶质。白蛋白（白蛋白（albumin）又称清蛋白，白蛋白是）又称清蛋白，白蛋白是血浆蛋白中含量最高（血浆蛋白中含量最高（3.84.8%）、分子量）、分子量最小、分子数最多的一类蛋白质。最小、分子数最多的一类蛋白质。白蛋白对治疗因失血、创伤、烧伤等引起的白蛋白对治疗因失血、创伤、烧伤等引起的休克，脑水肿和大脑损伤性所致的脑压增高，休克，脑水肿和大脑损伤性所致的脑压增高，防止低蛋白血症，肝硬化或者由肾病引起的水防止低蛋白血症，肝硬化或者由肾病引起的水肿与腹水等严重疾病具有良好疗效。肿与腹水等严重疾病具有良好疗效。白蛋白为单链
29、分子，由白蛋白为单链分子，由584个氨基酸残基个氨基酸残基组成，组成，N端为天门冬氨酸，端为天门冬氨酸，C端为亮氨酸，端为亮氨酸，分子量为分子量为6.6104，在离子强度为，在离子强度为0.15时，时，pI为为4.7，易溶于水，在，易溶于水，在60%硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度以上沉淀。对酸较稳定，受热变性。以上沉淀。对酸较稳定，受热变性。从人体中分离的白蛋白有两种：从人体中分离的白蛋白有两种：一种是一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。盘白蛋白。血（无抗凝剂）血（无抗凝剂
30、）自然凝固自然凝固分离出血清分离出血清（无纤维蛋白酶原、凝血因子等）（无纤维蛋白酶原、凝血因子等）血血+混合抗凝剂混合抗凝剂 草酸铵草酸铵草酸钾草酸钾离离 心心上清血浆上清血浆总蛋白：总蛋白：6.2-7.9%白蛋白：白蛋白：3.8-4.8%水：水：90-92%（现常用肝素、柠檬酸钠）（现常用肝素、柠檬酸钠）（2 2）工艺路线（图）工艺路线（图3-13-1）图图3-1 3-1 白蛋白生产工艺路线白蛋白生产工艺路线利凡诺利凡诺,NaHCO3pH8.6,离心分离离心分离络合物蒸馏水，蒸馏水，NaCl，HCl弱酸性，弱酸性，40，离心，离心离心液浓浓 缩缩超超 滤滤浓缩液灭活病毒灭活病毒 65，1h；
31、60，10h热处理液除菌除菌过滤白蛋白液干燥冷冻干燥白蛋白去杂蛋白人血浆（人血浆（%）（3 3）工艺要点）工艺要点 络合络合对于络合所要求的对于络合所要求的pH值，可以略高些，这样，白蛋值，可以略高些，这样，白蛋白络合完全，络合物形成一个相当硬的块，倾倒上清白络合完全，络合物形成一个相当硬的块，倾倒上清液方便，损失少。但液方便，损失少。但不能太高，以防络合血浆中的其不能太高，以防络合血浆中的其它蛋白，影响解离与白蛋白制剂的纯度。它蛋白，影响解离与白蛋白制剂的纯度。若若pH值偏低，络合不完全，络合物松软，甚至成汤值偏低，络合不完全，络合物松软，甚至成汤状，不利于倾去上清液。状，不利于倾去上清液。
32、血浆搅拌用血浆搅拌用NaHCO3调节调节pH至至8.5-8.7之间，缓慢加之间，缓慢加入与血浆等体积的入与血浆等体积的2.3%利凡诺溶液，边加边搅拌，充利凡诺溶液，边加边搅拌，充分络合后。分络合后。静置静置24h，分离上清与络合物沉淀。，分离上清与络合物沉淀。F加入加入2.3%利凡诺溶液比加入利凡诺溶液比加入5%利凡诺溶液利凡诺溶液的效果好？的效果好？因为加因为加5%利凡诺溶液常造成灭活利凡诺溶液常造成灭活时白蛋白部分变性或者分装困难。加入时白蛋白部分变性或者分装困难。加入2.3%利凡诺溶液的体积一般不超过血浆体积的一半利凡诺溶液的体积一般不超过血浆体积的一半。这可能是加入利凡诺溶液除去了解离
33、物中过。这可能是加入利凡诺溶液除去了解离物中过多的多的Cl-而澄清，或者是加入的利凡诺（过量而澄清，或者是加入的利凡诺（过量）使白蛋白与利凡诺的络合物反溶，从而使造）使白蛋白与利凡诺的络合物反溶，从而使造成混浊的物质消失，达到澄清的目的。成混浊的物质消失，达到澄清的目的。解离解离生产中要严格控制溶液的温度。生产中要严格控制溶液的温度。25左右室温，络合物形成一个硬块，利于去左右室温，络合物形成一个硬块，利于去上清和解离。温度太低，虽然不影响络合，但络上清和解离。温度太低，虽然不影响络合，但络合物呈稀糊状，倾倒上清液时常会丢失部分络合合物呈稀糊状，倾倒上清液时常会丢失部分络合物，而且络合物内残存
34、较多的利凡诺的水溶液。物，而且络合物内残存较多的利凡诺的水溶液。解离温度要维持在解离温度要维持在40左右，是解离反应的最左右，是解离反应的最适温度。适温度。解离液的解离液的pH值在值在1.281.45之间，解离效果良好。之间，解离效果良好。络合物中加入解离液并搅拌均匀后，将解离后混络合物中加入解离液并搅拌均匀后，将解离后混合溶液合溶液pH值控制在值控制在6.0左右较理想。左右较理想。p以解离后解离混合溶液以解离后解离混合溶液pH值决定加入解离液的体值决定加入解离液的体积。积。p解离后解离混合液的解离后解离混合液的pH值高于值高于6.5时，表明加入时，表明加入的解离液少了，有部分络合物未被解离开
35、；的解离液少了，有部分络合物未被解离开；p低于低于5.85，表明加入的解离液多了，解离过度。，表明加入的解离液多了，解离过度。这两种情况下，解离效果均不佳。这两种情况下，解离效果均不佳。在沉淀中加约二分之一血浆体积在沉淀中加约二分之一血浆体积的灭菌蒸馏水解离所得到的络合物的灭菌蒸馏水解离所得到的络合物沉淀，将解离混合物溶液用沉淀，将解离混合物溶液用0.5mol/L HCl调节调节pH至至5.5-6.0，加，加NaCl至至0.15%0.2%，充分搅拌、，充分搅拌、40过过夜解离（夜解离（8-10h）。）。在生产过程中常发现，由于解离效果差，从而在生产过程中常发现，由于解离效果差，从而不能使生产过
36、程顺利进行。方法：不能使生产过程顺利进行。方法：（1）加入活性炭法：）加入活性炭法：在解离效果略差，即在解离效果略差，即能够较顺利地离心，得到部分或全部稍混浊的能够较顺利地离心，得到部分或全部稍混浊的滤液，但不能正常进行压滤时，加入适当的活滤液，但不能正常进行压滤时，加入适当的活性炭于滤液中，搅拦均匀后，立即离心，由于性炭于滤液中，搅拦均匀后，立即离心，由于活性炭吸附溶液中粘稠物质，形成大颗粒，经活性炭吸附溶液中粘稠物质，形成大颗粒，经离心可以除去杂质，起到澄清的作用。离心可以除去杂质，起到澄清的作用。（2）加入利凡诺法：）加入利凡诺法：在解离时，在由加入的在解离时，在由加入的盐酸或（和）盐过
37、多而造成解离物的滤液混浊盐酸或（和）盐过多而造成解离物的滤液混浊的情况下，的情况下，变性前后，向解离物中加入适量的变性前后，向解离物中加入适量的利凡诺溶液均会起到澄清的作用，而回收率却利凡诺溶液均会起到澄清的作用，而回收率却不会降低太多。不会降低太多。F变性前加利凡诺溶液比变性后加利凡诺溶液变性前加利凡诺溶液比变性后加利凡诺溶液的效果显著。的效果显著。由于前者在变性过程中反应温度由于前者在变性过程中反应温度升高了，反应时间增加了。升高了，反应时间增加了。（3）多次络合法）多次络合法p如果解离效果极差，用以上两种方法处理都如果解离效果极差，用以上两种方法处理都难以达到澄清的目的，那只有采取多次络
38、合法难以达到澄清的目的，那只有采取多次络合法，即在尽量除去解离物中粘稠物质后，将其，即在尽量除去解离物中粘稠物质后，将其pH值调至值调至9.09.2，加入适量的，加入适量的5%利凡诺溶液，利凡诺溶液，进行重络合，继尔重解离，一般都会得到很理进行重络合，继尔重解离，一般都会得到很理想结果。如果仍然出现解离不良的现象，重复想结果。如果仍然出现解离不良的现象，重复以上处理过程，直到得到满意的结果。以上处理过程，直到得到满意的结果。p这种方法使产品纯度高，外观变黄（棕），这种方法使产品纯度高，外观变黄（棕），同时也使成本提高，回收率降低。同时也使成本提高，回收率降低。去杂蛋白：去杂蛋白：白蛋白具有生物
39、活性，凡是白蛋白具有生物活性，凡是使蛋白质变性的温度都会使白蛋白变性。使蛋白质变性的温度都会使白蛋白变性。65条件下变性条件下变性1h，离心分离出上清液。，离心分离出上清液。热处理热处理：在：在600.5条件下处理条件下处理10h，灭活病毒。灭活病毒。检验方法：检验方法：冻干品白色疏松物体。白蛋冻干品白色疏松物体。白蛋白含量占白含量占95%以上，水分以上，水分1%，水溶后，水溶后pH为为6.6-7.2，硫酸铵残量，硫酸铵残量15000 IU/mg蛋白质。蛋白质。三、绒膜促性激素（三、绒膜促性激素（HCGHCG）的制备）的制备（1）HCG的性质（的性质（character of HCG）HCG是
40、一种糖蛋白，由是一种糖蛋白，由、两亚基组成，两亚基组成，易溶于水，易溶于水，pI为为3.2-3.3。HCG由胎盘滋养层由胎盘滋养层合体细胞所分泌。妇女妊娠合体细胞所分泌。妇女妊娠45-70天，尿中天，尿中HCG含量可达含量可达30.000-50.000IU/24h。治疗女性不育症，神经性皮炎。男性性功能治疗女性不育症，神经性皮炎。男性性功能过低症和隐睾症，子宫出血和习惯性流产。过低症和隐睾症，子宫出血和习惯性流产。图图3-3 HCG生产工艺路线生产工艺路线孕妇尿粗制粗制尿：苯甲酸：乙醇尿：苯甲酸：乙醇/1：0.075：5）用用HCl调调pH 4-5HCG(粗品）提取提取NaAC pH4.8提取
41、液透析透析水，水，5以下以下透析内液吸附（吸附（CM SepharoseCI-6B）羧甲基琼脂糖凝胶羧甲基琼脂糖凝胶吸附后交换剂洗涤洗涤，峰峰NaAC,pH4.8,pH5.9洗涤后交换剂洗脱洗脱NaAC,pH8.5洗脱液冷冻干燥冷冻干燥 30HCG精品 溶解溶解蒸馏水，蒸馏水，10以下以下HCG溶液透析透析pH6.8,5以下以下透析内液吸附吸附羟基磷灰石，羟基磷灰石，pH6.8吸附物解吸解吸0.5mmol/L,1.0mmol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS),pH6.8解吸液干燥干燥30HCG纯品（2 2）HCGHCG生产工艺路线生产工艺路线（3 3）工艺要点）工艺要点p吸附粗品：吸附粗
42、品：HCl调孕妇尿至调孕妇尿至pH4-5，加苯，加苯甲酸甲酸乙醇饱和液（孕妇尿：苯甲酸乙醇饱乙醇饱和液（孕妇尿：苯甲酸乙醇饱和液：乙醇和液：乙醇=1:0.075:5）搅拌）搅拌1h静置静置2-3h，过滤，弃滤液，得吸附物。在搅拌下加入过滤，弃滤液，得吸附物。在搅拌下加入95%乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮状沉淀产乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮状沉淀产生，静置过夜，离心，沉淀用生，静置过夜，离心，沉淀用95%乙醇和丙乙醇和丙酮洗涤，干燥得粗制品酮洗涤，干燥得粗制品。p提取：加提取：加10倍量的倍量的41/15 mol/L、pH4.8醋醋酸盐缓冲液，搅拌酸盐缓冲液，搅拌4h，离心，取上清液。沉淀再，离心，
43、取上清液。沉淀再提取提取2h。合并两次提取液，弃去沉淀。合并两次提取液，弃去沉淀。p离子交换层析：离子交换层析：CM-Sepharose柱用柱用0.01mol/L的醋酸盐缓冲液平衡后样品上柱。依的醋酸盐缓冲液平衡后样品上柱。依次用次用pH4.8、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和的醋酸盐缓冲液和pH5.9、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤出两个峰（杂的磷酸盐缓冲液洗涤出两个峰（杂质）。再用质）。再用pH8.5、0.2mol/L的醋酸盐缓冲液洗的醋酸盐缓冲液洗脱，得到的第脱，得到的第3峰即为峰即为HCG。p羟基磷灰石柱层析：柱用羟基磷灰石柱层析：柱用pH6.8、0.5mmol/L磷酸盐缓冲液
44、平衡。样品用磷酸盐缓冲液平衡。样品用pH6.8、0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液进行层析上柱。的磷酸盐缓冲液进行层析上柱。洗脱先用洗脱先用pH6.8、0.5mmol/L再用再用pH6.8 1.0mmol/L的磷酸盐缓冲液。得到的磷酸盐缓冲液。得到I、II活性峰活性峰。然后冷冻干燥。然后冷冻干燥。HCG纯品的比活性为纯品的比活性为10,000-12,000IU/mg蛋白质。蛋白质。四、白细胞介素四、白细胞介素-2（IL-2）的制备）的制备 （1 1）性质：由活化的淋巴细胞所产生的，糖蛋白有一）性质：由活化的淋巴细胞所产生的，糖蛋白有一个链内二硫桥（个链内二硫桥（5858位，位，105105位）。
45、等电点为位）。等电点为pH6.5pH6.5。（2 2）工艺路线（图）工艺路线（图3-43-4）诱生白细胞培养液0.4mol/L NaCl,PBS,pH6.5UltrogelACA44柱，柱，pH7.6图图3-4为为IL-2生产工艺路线生产工艺路线人血白细胞诱生诱生鸡瘟病毒，丝裂原培养液，鸡瘟病毒，丝裂原培养液，37，CO2,孵育孵育灭活病毒灭活病毒 HCl,pH2.0-2.5；NaOH,pH7.2-7.4上清液硫酸胺分级（硫酸胺分级（0.35饱和度）饱和度）离心离心 去变性杂蛋白去变性杂蛋白上清液硫酸胺沉淀（硫酸胺沉淀（0.85饱和度）饱和度）离心离心沉淀除盐除盐10mmol/L磷酸钠缓冲液，
46、磷酸钠缓冲液，PBS透析，透析，pH6.5透析内液琼脂糖琼脂糖Sepharose4B,pH6.5亲和层析亲和层析亲和层析载体洗涤洗涤亲和层析载体解吸解吸1.0mol/LNaCl,PBS,pH6.5IL-2组分凝胶层析凝胶层析凝胶载体0.2mol/L Tris-HCl,含含0.1%PEG,2%正丁正丁醇，醇，0.5mol/L甘氨酸，甘氨酸，pH7.6洗脱洗脱IL-2去变性杂蛋白去变性杂蛋白（3 3）工艺要点）工艺要点 p诱生：刺激人外周血白细胞，诱生：刺激人外周血白细胞，37培养。培养。p病毒灭活和固液分离：病毒灭活和固液分离：HCl调节调节pH再用再用NaOH调调,除去变性杂蛋白。除去变性杂蛋
47、白。p分级沉淀：加饱和硫酸铵溶液至分级沉淀：加饱和硫酸铵溶液至0.35饱和度饱和度，4静置静置24h，离心，收集沉淀。，离心，收集沉淀。p除盐：除沉淀溶于除盐：除沉淀溶于pH6.5、10mmol/L的磷酸的磷酸钠缓冲液（钠缓冲液（PBS）中（内含）中（内含2%（g/100mL）正）正丁醇丁醇,0.15mol/L NaCl）。用）。用pH6.5的的10mmol/L PBS透析透析24h（更换（更换5次透析外液）。次透析外液）。p 蓝 色 琼 脂 糖 层 析：透 析 内 液 通 过蓝 色 琼 脂 糖 层 析：透 析 内 液 通 过Sepharose 4B层析柱，用层析柱，用200mL平衡柱缓冲液平
48、衡柱缓冲液洗去不吸附蛋白，再用含洗去不吸附蛋白，再用含0.4mol/L NaCl的的PBS液洗涤亲和柱，最后用含液洗涤亲和柱，最后用含1.0mol/L NaCl的的PBS液解吸液解吸IL-2活性组分。活性组分。p 凝胶层析：活性组分经超滤浓缩，上凝胶层析：活性组分经超滤浓缩，上Ultrogel ACA44层析柱，柱用含层析柱，柱用含0.1%聚乙二聚乙二醇醇MW6000的的2%正丁醇和正丁醇和pH7.6的的0.5mol/L甘甘氨酸的氨酸的0.2mol/L Tris-HCl洗脱，得洗脱，得IL-2。五、人体来源药物的研究前景五、人体来源药物的研究前景（prospect）人体来源的原料虽只限于血液、
49、胎盘、尿人体来源的原料虽只限于血液、胎盘、尿液、毛发等有限几种，但利用前景很广阔。液、毛发等有限几种，但利用前景很广阔。1、可进一步开发新产品、可进一步开发新产品 exploitation of new productio）（1）血液的利用，）血液的利用，血浆蛋白可分离为血浆蛋白可分离为I-V5个个成分。目前仅利用了其中的成分。目前仅利用了其中的I（纤维蛋白原）（纤维蛋白原）、II（免疫球蛋白）和（免疫球蛋白）和V（白蛋白）（白蛋白）3个组分个组分，III和和IV，目前基本未加以利用。，目前基本未加以利用。p组分组分III中含有中含有IgA、IgM、凝血因子、凝血因子II、VII、IX、X、蛋
50、白、蛋白C、纤溶酶原、纤溶酶原、2-巨球巨球蛋白、蛋白、-微球蛋白、补体成分微球蛋白、补体成分C3、C4、C5和和C8，以及许多其他，以及许多其他和和球蛋白。球蛋白。p组分组分IV中含有抗凝血酶中含有抗凝血酶III、I抗胰蛋白抗胰蛋白酶、铜蓝蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白、补酶、铜蓝蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白、补体体Ci脂酶抑制物、前白蛋白等。主要问题脂酶抑制物、前白蛋白等。主要问题是含量较低，提纯难度大，产量小而不被是含量较低，提纯难度大，产量小而不被重视。重视。（2 2）对其他原料的利用）对其他原料的利用，胎盘是重，胎盘是重要的人类原料之一，较好利用要的人类原料之一，较好利用的只有胎盘球蛋白、胎盘
