1、实时荧光定量PCR原理及应用主要内容 荧光定量PCR原理 荧光定量PCR方法与应用 在在PCR反应体系中，加入荧光集团，反应体系中，加入荧光集团，利用利用荧光信号的累积荧光信号的累积对对PCR反应过程反应过程实时监控实时监控，最终对初始，最终对初始模板进行定量模板进行定量。传统的传统的PCR定量是一种终点法的检测定量是一种终点法的检测：动态范围受限 检测重现性极差 实时定量实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测：依靠荧光信号的扩增进行检测：灵敏度高 重复性 好 动态范围宽 高通量11,500 counts/5200 counts=2.2 fold differenceCt 18 and Ct
2、 22,2(4 Ct shift)=16 fold differenceCt终点检测终点检测重复性好精确度高误差小 阈值阈值threshold：在荧光信号指数扩增阶段，在荧光信号指数扩增阶段，在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值，在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值，一般我们将荧光阈值的缺省设置是一般我们将荧光阈值的缺省设置是 3-15 3-15 个个循环的荧光信号的标准偏差的循环的荧光信号的标准偏差的10 10 倍。倍。CT=cycle threshold即阈值循环数：荧光信即阈值循环数：荧光信号达到阈值设定值时号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数所经历的循环数。阈值与CT值检测极限DNA
3、Cycle CtCtCt阈值thresholdC(t)值与阈值 起始模板浓度的对数起始模板浓度的对数与与C(t)值成反比值成反比 绘制标准曲线 所测样本C(t)值 定量标标 准准 曲曲 线线通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品的Ct值，依据 Log起始拷贝量与Ct的线性关系，就可以计算出样品中所含的模板量荧光染料法荧光探针法SYBR Green ITaqManMolecular BeaconsDNA bindingProbe based detectionTaqTaq染料和探针SYBR Green:最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm 染料只与双链DNA小沟
4、结合，单链不结合游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度增强1000倍 不能区分引物二聚体，单链二级结构，非特异性产物需要做熔解曲线分析产物的单一性SYBR green 是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势，在试验验证和问题分析上非常有用。SYBR Green法作用机理熔解曲线分析单一峰，无非特异性产物，定量准确有杂峰，有非特异性产物，定量不准确unbound probefree in solutionLight emissionLightenergy transferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLight emissionLight特点：特
5、点：特异性高：只有引物和探针都和同一模板结合时才能检测完全实时监测：一分子荧光信号对应一条DNA链的产生多通道检测：可以在一次反应中同时检测多个不同目的基因序列Taqman探针法Taqman探针：是与目的序列互补的寡聚核苷酸，5端标记荧光报告集团，3端标记荧光淬灭集团，探针完整时不发出荧光，水解后发出荧光。HCV(FAM)RNA virus65bp ampliconHIV-1(HEX)RNA Virus74bp ampliconHBV(CY5)DNA virus 81bp ampliconTaqman 三通道实验三通道实验Daniel Candotti-Cambridge,UK绝对定量相对定量
6、SNP分析应用之一：病原体检测与定量绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数病原绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数病原体的多少）体的多少）标准品（如质粒）：做系列梯度稀释标准品（如质粒）：做系列梯度稀释待测样本待测样本阴性对照（阴性对照（NTCNTC）应用之一：病原体检测与定量应用之一：病原体检测与定量应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的倍数倍数两种样品：两种样品：CalibratorCalibrator（对照，如正常组织）（对照，如正常组织）与与SampleSample（待测样品）（待测样品）两个基
7、因：目的基因与看家基因两个基因：目的基因与看家基因Normalizer看家基因看家基因应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析CalibratorSampleGene of Interest目的基因目的基因CtCtCtCt Ct1 Ct2应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析基因表达差异基因表达差异2 /2 Ct1 Ct2 Ct1-Ct2应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析RNA抽提抽提RT定量定量PCRcDNA产物产物系列稀释系列稀释两个基因的扩增效率两个基因的扩增效率应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析两条
8、探针分别针对不同等位基因应用之三：应用之三：SNPSNP分析分析应用之三：应用之三：SNPSNP分析分析FAMFAMTETTETFAMFAMTETTET应用之三：应用之三：SNPSNP分析分析Thank youThank you！选择吉泰，选择成功！选择吉泰，选择成功！PCR是精确性很高的实验，实验前我们需要完整的实验设计方案，而且实验条件对结果影响也很大。PCR扩增效率：保证实验的精确性和重复性。影响扩增效率的因素：扩增子长度；扩增子GC含量；扩增子、引物、探针二级结构；PCR各组分反应浓度；模板浓度。扩增片段100-200bp 引物长度18-30bp，Tm在58-62之间，上下游引物Tm值
9、不超过2 GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基，3端不为G或C。避免引物内二级结构，引物间二聚体出现。跨外显子设计引物，消除基因组DNA扩增 Taqman探针长度25-32bp，Tm在68-72之间，确保比引物的Tm值大5-10 GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基 5端不能为G，G能淬灭荧光信号 Taqman探针要靠近上游引物，最好只有一个碱基距离。避免探针与引物间形成二级结构 SNP位点应设计在探针中间位置 基本参数的优化基本参数的优化 MgCl2的浓度，DNA：2-5mM;mRNA：4-8mM。模板浓度，系列稀释梯度模板，CP在15-30之间。而CP值的确定经验上是SYB
10、RGreen荧光信号是本底的2倍，杂交探针荧光强度是本底的0.3倍。使用使用SYBRGreen测定测定DNA的优化的优化 MgCl2的浓度，2-4mM 模板浓度，DNA：50ng-5pg；质粒：106拷贝 引物浓度，0.3uM 退火浓度，比计算出的Tm小5 使用使用SYBRGreen进行一步法进行一步法RT-PCR的条的条件优化件优化 MgCl2的浓度，4-8mM 模板浓度，总RNA或mRNA：1pg-1ug 杂交探针测定杂交探针测定DNA MgCl2的浓度，不要超过2mM 探针浓度，0.2uM 杂交探针进行实施定量杂交探针进行实施定量RT-PCR MgCl2的浓度，4-8mM之间 探针浓度，
11、0.2uM 模板浓度设置，1pg-1ug的总RNA或是mRNA荧光定量PCR仪的硬件条件激发光源激发光源热循环加热、制冷热循环加热、制冷 样品样品检测设备检测设备荧光定量PCR仪应满足的要求 光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.Stratagene 公司成立于公司成立于1984年年,致力于致力于发展生命科学领域的创新产品与科技发展生命科学领域的创新产品与科技.总部位于美国总部位于美国 La Jolla,California.在欧在欧洲与日本设有分公司洲与日本设有分公司.2007年被年被Agilent公司收购，成为公司收购，成为Agilent公司旗下品牌。公司旗下品牌。Stratagene 公司简介公司简介Mx3000P 整体设计热盖热循环系统石英卤钨灯发射光滤镜轮激发光滤镜轮光纤扫描臂石英卤钨灯的激发光源：超长的激发光范围350-750nm多通道设计，滤光片可灵活定制卓越的孔间均一性和温度控制，72时+0.25光学扫描设计:避免边缘效应；光电倍增管增加检测的灵敏度内置芯片，具有断电保护功能人性化的软件，实时监测，直观易用，功能强大开放的平台，选择你心仪的试剂与耗材完善的售后支持，您的满意是我们最大的目标
