1、碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AKP)的分离纯的分离纯化化生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系 袁野袁野实验目的实验目的:从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验，培养从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验，培养同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。的技能。实验原理：实验原理：采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱性磷酸酶。性磷酸酶。AKPAKP溶于溶于30%30%乙醇或乙醇或33%33%丙酮丙酮。但在。但在60%60%的乙醇的乙醇或或50%50%丙酮丙酮中
2、则形成沉淀。通过离心可以使中则形成沉淀。通过离心可以使AKPAKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的的AKPAKP。有机溶剂沉淀概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。原理原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自
3、由水的由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚了亲水性，导致脱水凝聚。常用的有机溶剂沉析剂乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；范围不广；特点：特点：介电常数小介电常数小:60%:60%乙醇的介电常数是乙醇的介电常数是4848 丙酮的介电常数是丙酮的介电常数是2222容易获取容易获取
4、有机溶剂沉析的特点分辨率高；分辨率高；溶剂容易分离，并可回收使用；溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；产品洁净；容易使蛋白质等生物大分子失活；容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在低温下操作；应注意在低温下操作；影响有机溶剂沉析的主要因素温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；（溶解度下降）；搅拌速度：散热搅拌速度：散热溶液溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（电荷，防止共沉现象。（pI）离子强度离子强度:离子强度低有利于沉析，离子强度低有利于沉析，0.010.
5、05mol/L样品浓度样品浓度:0.52%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低金属离子的助沉析作用：金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+1.1.称取兔肝称取兔肝2g2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入加入0.01 M0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml4ml,进行匀浆。转入离心管，并加进行匀浆。转入离心管，并加2ml 2ml 0.01 M0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将
6、之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录记录体积体积a a，取，取0.1ml0.1ml作为作为A A液液于于EPEP管，待管，待测比活性用。测比活性用。2.2.在离心管中剩余的液体加入在离心管中剩余的液体加入2ml2ml正丁醇，正丁醇，玻璃棒搅拌玻璃棒搅拌 2min2min，室温放置，室温放置30min30min，纱，纱布过滤，置于离心管。布过滤，置于离心管。3.3.滤液加入滤液加入等体积的冷丙酮等体积的冷丙酮，边倒边摇，边倒边摇，混匀后混匀后3000r/min 5min3000r/min 5min。弃上清弃上清，沉淀，沉淀用用4ml 0.5M Mg(AC)
7、4ml 0.5M Mg(AC)2 2溶解。记录溶解。记录体积体积b b。取取0.1ml0.1ml作为作为B B液液于于EPEP管，待测比活性用。管，待测比活性用。4.(1)于悬液中于悬液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为30%（0.46体积体积），混匀后），混匀后2000r/min 5min，转移，转移上上清清于另一离心管。于另一离心管。(2)上清液中上清液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为60%（0.85体积体积），混匀后），混匀后3000r/min 5min，弃上清弃上清，沉淀用沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅拌
8、混混合液搅拌混悬。悬。5.(1)于悬液中于悬液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为30%（0.46体积体积），混匀后），混匀后2000r/min 5min，转移，转移上上清清于离心管，弃沉淀。于离心管，弃沉淀。(2)上清液中上清液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为60%（0.85体积体积），混匀后），混匀后3000r/min 5min，弃上清弃上清，沉淀用沉淀用3ml 0.5M Mg(AC)2溶解溶解,记录记录体积体积c。取。取0.1ml作为作为C液液于于EP管管,待测比活性用。待测比活性用。6.（1）其余悬液中其余悬液中缓慢缓慢加入冷丙酮，使
9、得丙酮的体积分加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达到数达到33%（0.5体积），混匀后体积），混匀后2000r/min 离心离心5min，取上清取上清（弃沉淀）（弃沉淀）（2）上清中上清中缓慢缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到50%(0.34体积），混匀后体积），混匀后3000r/min离心离心15min，弃上弃上清清（3）沉淀中加入沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。，即为纯化酶液。作为作为D液液用于比活性测定。用于比活性测定。用于活性测定：用于活性测定：用用Tris-Mg(AC)2缓冲液将缓冲液将 A液稀释液稀释25倍、倍、B液稀
10、释液稀释10倍、倍、C液稀释液稀释5倍，倍，D液不稀释。液不稀释。用于含量测定用于含量测定：用：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将缓冲液将 A液稀释液稀释50倍、倍、B液稀释液稀释20倍、倍、C液稀释液稀释5倍，倍，D液不稀释。液不稀释。(二二)碱性磷酸酶的活性测定碱性磷酸酶的活性测定实验原理：实验原理：AKP是一种底物特异性较低，在碱性是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适环境中能水解磷酸基团。最适pH范围为范围为8.810,需要镁离子作为激活剂。需要镁离子作为激活剂。血清血清AKP主要来自肝，小部分来自骨主要来自肝，小部分来自骨骼。骼。酶的活性通常是在一定条件下（最适温酶的
11、活性通常是在一定条件下（最适温度、最适的度、最适的pH、必要的激动剂等），一定、必要的激动剂等），一定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物的生成量来确定。底物的消耗量或产物的生成量来确定。磷酸苯二钠磷酸苯二钠磷酸盐磷酸盐 +酚酚AKP酚酚 +4-氨基安替比林氨基安替比林红色醌类衍生物红色醌类衍生物铁氰化钾铁氰化钾管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1酚标准液酚标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1复合底物复合底物 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.01.取试管取试管6支编号
12、（体积单位为支编号（体积单位为ml）2.加入底物后加入底物后,立即混匀立即混匀,37 准确准确15 min后加后加入入0.5%铁氰化钾铁氰化钾2.0 ml终止反应终止反应,混匀混匀,静置静置15 min,510 nm比色比色（大比色杯）（大比色杯）AKP纯化程度鉴定AKP纯化程度用酶的比活性反映。纯化程度用酶的比活性反映。酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。酶活性。BCA法测定法测定AKP蛋白浓度蛋白浓度BCA(bicinchoninic acid,二喹啉甲酸二喹啉甲酸)Protein+Cu2+OH-Cu+BCA 试剂试剂 紫色复合物紫色复合物(
13、三三)碱性磷酸酶的蛋白含量测定碱性磷酸酶的蛋白含量测定管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1蛋白标准液蛋白标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1BCA试剂试剂 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.51.取试管取试管6支编号支编号（体积单位为（体积单位为ml）2.混匀后混匀后37水浴水浴30min,562nm30min,562nm比色（比色（小比色杯）小比色杯）管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1酚标准液酚标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1复合底物复合底物 3.0 3
14、.0 3.0 3.0 3.0 3.0管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1蛋白标准液蛋白标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1BCA试剂试剂 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.51.取试管取试管6支编号支编号（体积单位为（体积单位为ml）酶活性测定）酶活性测定2.取试管取试管6支编号支编号（体积单位为（体积单位为ml）酶蛋白含量测定）酶蛋白含量测定管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1酚标准液酚标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1复合底物复合底物 3.0 3.0 3.
15、0 3.0 3.0 3.01.取试管取试管6支编号（体积单位为支编号（体积单位为ml）2.加入底物后加入底物后,立即混匀立即混匀,37 准确准确15 min后加后加入入0.5%铁氰化钾铁氰化钾2.0 ml终止反应终止反应,混匀混匀,静置静置15 min,510 nm比色比色（大比色杯）（大比色杯）722S型分光光度计使用方法型分光光度计使用方法1.1.开机预热开机预热15min15min以上（打开盖预热）。以上（打开盖预热）。2.2.转动波长选择钮，选用所需的波长。转动波长选择钮，选用所需的波长。3.3.将装有空白、标准、样品的比色杯放入比色杯架，使将装有空白、标准、样品的比色杯放入比色杯架，
16、使空白管空白管对对准光路。准光路。4.4.按按MODEMODE 键选择键选择transtrans模式。模式。5.5.打开样品室暗箱盖（光门自动关闭），按打开样品室暗箱盖（光门自动关闭），按0%ADJ0%ADJ 键，即能自动键，即能自动进行机械零点的调整，数码显示为进行机械零点的调整，数码显示为0.0000.000。6.6.盖好比色杯暗箱盖（光门自动开启），按盖好比色杯暗箱盖（光门自动开启），按100%ADJ100%ADJ 键，即能自键，即能自动进行空白零点的调整，数码显示为动进行空白零点的调整，数码显示为100.0100.0。（一次如有误差。（一次如有误差可再按一次）可再按一次）7.7.按按M
17、ODEMODE 键选择吸光度测定模式（键选择吸光度测定模式（ABSABS灯亮），数码显示自动转灯亮），数码显示自动转换为吸光度值换为吸光度值0.0000.000。8.8.拉动比色杯架的拉杆，使测定杯进入光路，从数码显示上即可拉动比色杯架的拉杆，使测定杯进入光路，从数码显示上即可读出样品的吸光度读出样品的吸光度 9.9.比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，清洗比色杯并晾干。清洗比色杯并晾干。1.1.分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随意搬动，严防振动
18、，潮湿和强光直射。分光光度计内放有硅胶意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。干燥袋，需定期更换。2.2.开机预热开机预热1515分钟，待仪器稳定以后再开始进行测定。每年需定分钟，待仪器稳定以后再开始进行测定。每年需定期进行波长校准。期进行波长校准。3.3.必须保证测试样品为澄清的溶液，肉眼看不出来的轻微浊度也必须保证测试样品为澄清的溶液，肉眼看不出来的轻微浊度也能引起读数的严重误差，必要时可通过离心来去除微粒。检测能引起读数的严重误差，必要时可通过离心来去除微粒。检测细菌培养液的光吸收时例外。细菌培养液的光吸收时例外。4.4.从冰箱中取出的样品一定要恢复到室
19、温后再进行检测，否则低从冰箱中取出的样品一定要恢复到室温后再进行检测，否则低温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起读数持续漂移上升。温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起读数持续漂移上升。使用分光光度计的注意事项使用分光光度计的注意事项5.5.比色杯盛液量以达到杯容积比色杯盛液量以达到杯容积2/32/3左右为宜。比色杯的外表面，则左右为宜。比色杯的外表面，则必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净，然后才能把比色必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净，然后才能把比色杯放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀杯放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。机件。6.6.不可用手拿比
20、色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光学面。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，学面。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，也可用甲醇冲洗。洗涤后应把比色杯倒置晾干或用滤纸条将水也可用甲醇冲洗。洗涤后应把比色杯倒置晾干或用滤纸条将水吸去，再用擦镜纸轻轻揩干。吸去，再用擦镜纸轻轻揩干。7.7.一定要保证比色皿正确放入光路后再进行测量。一定要保证比色皿正确放入光路后再进行测量。8.8.一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.20.20.70.7的范围内进行的范围内进行测定。这样所测得的读
21、数误差较小。如吸光度不在此范围内，测定。这样所测得的读数误差较小。如吸光度不在此范围内，可调节样品溶液浓度，适当稀释或加浓，使其在仪器准确度较可调节样品溶液浓度，适当稀释或加浓，使其在仪器准确度较高的范围内进行测定。高的范围内进行测定。A样样A标标 标准管中酚含量标准管中酚含量0.1mg/ml 稀释倍数稀释倍数A样样A标标 标准管中蛋白含量标准管中蛋白含量0.2mg/ml 稀释倍数稀释倍数酶活性单位计算：酶活性单位计算：蛋白质含量计算蛋白质含量计算:比活性计算比活性计算AKP比活性比活性=每毫升样品的酶活性单位每毫升样品的酶活性单位每毫升样品的蛋白毫克数每毫升样品的蛋白毫克数纯化倍数纯化倍数=
22、每步比活性每步比活性初提液比活性（初提液比活性（A液体）液体）总活力总活力=酶活性单位酶活性单位体积体积得率得率=每步总活力每步总活力初提液总活力（初提液总活力（A液体）液体）分离分离阶段阶段蛋白质蛋白质mg/ml酶活性酶活性U/ml比活性比活性U/mg纯化纯化倍数倍数得率得率ABCD后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考，实际情况实际分析主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field
