1、酶免疫技术酶免疫技术 EIA拟探讨的问题拟探讨的问题ELISAELISA的原理的原理ELISAELISA的试剂（三个必要试剂）的试剂（三个必要试剂）ELISAELISA的类型的类型ELISAELISA的过程的过程ELISAELISA的操作要点的操作要点酶免疫技术的定义酶免疫技术的定义酶免疫技术的类型酶免疫技术的类型酶免疫技术的发展酶免疫技术的发展概念概念以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。一种免疫检测技术。常用的酶
2、及显色底物常用的酶及显色底物常用酶常用酶底物底物加终止液前加终止液前颜色颜色加终止液后加终止液后颜色颜色辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRP）邻苯二胺（邻苯二胺（OPD）橙黄色橙黄色橙黄色橙黄色 四甲基联苯胺四甲基联苯胺（TMB）蓝色蓝色黄色黄色碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AP）对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯（p-NPP）黄色黄色黄色黄色酶免疫技术类型（按抗原抗体系统的定位划分）（按抗原抗体系统的定位划分）酶免疫技术酶免疫技术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均相酶免疫测定（均相酶免疫测定（EMITEMIT、CEDIACEDIA）异相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免
3、疫测定固相酶免疫测定（如（如ELISAELISA）均相酶免疫测定均相酶免疫测定 利用酶标记物结合抗原抗体复合物后，标记酶的活性就利用酶标记物结合抗原抗体复合物后，标记酶的活性就受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物，受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物，直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量。常用于半抗的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量。常用于半抗原如药物、激素、毒品、兴奋剂等的测定。原如药物、激素、毒品、兴奋剂等的测定。酶免疫增强测定技术（酶免疫增强测定技术（EM
4、ITEMIT）酶活性的抑制是由于标记抗原与抗体结合后空间位阻了酶酶活性的抑制是由于标记抗原与抗体结合后空间位阻了酶与底物结合的部位而造成的。反应模式竞争法，当未标记与底物结合的部位而造成的。反应模式竞争法，当未标记抗原和标记抗原与限量的抗体竞争结合时，未标记抗原多，抗原和标记抗原与限量的抗体竞争结合时，未标记抗原多，竞争性的与抗体结合多，则标记抗原与抗体结合少，酶的竞争性的与抗体结合多，则标记抗原与抗体结合少，酶的活性受到抑制少，酶活性高。最终测的酶活性与未标记的活性受到抑制少，酶活性高。最终测的酶活性与未标记的抗原含量呈正相关。抗原含量呈正相关。抗体抗体酶酶抗体抗体酶酶半抗原半抗原（未标记）
5、（未标记）底物底物标记抗原标记抗原酶酶克隆酶供体免疫分析（克隆酶供体免疫分析（CEDIACEDIA）酶是以供体和受体两个片段存在的，只有两个片段结酶是以供体和受体两个片段存在的，只有两个片段结合在一起形成全酶才具有活性，当标记了供体酶的抗合在一起形成全酶才具有活性，当标记了供体酶的抗原与抗体结合后就空间位阻了酶供体（原与抗体结合后就空间位阻了酶供体（EDED）与酶受体）与酶受体（EAEA）的结合，从而不能形成有活性的全酶，酶活性）的结合，从而不能形成有活性的全酶，酶活性受到抑制。反应模式为竞争性结合。最终测的酶活性受到抑制。反应模式为竞争性结合。最终测的酶活性与未标记抗原的含量呈正相关。与未标
6、记抗原的含量呈正相关。EDED+标本中抗原标本中抗原EDED标记抗原标记抗原抗体抗体EDED+EAEAXEAEAEDED活性酶活性酶异相酶免疫测定异相酶免疫测定抗原抗体反应平衡后，体系中同时存在游离的和结合的酶抗原抗体反应平衡后，体系中同时存在游离的和结合的酶标记物，两种标记物上的酶都具活性，而只有结合的酶标标记物，两种标记物上的酶都具活性，而只有结合的酶标记物的形成与含量才代表待测物的存在与含量。故需将游记物的形成与含量才代表待测物的存在与含量。故需将游离的和结合的酶标记物分离，测定结合状态的酶标记物的离的和结合的酶标记物分离，测定结合状态的酶标记物的活性推算待测物的含量。由于分离方法不同，
7、又分为活性推算待测物的含量。由于分离方法不同，又分为液相酶免疫测定液相酶免疫测定游离的和结合的酶标记都存在于液相中，需用分离剂游离的和结合的酶标记都存在于液相中，需用分离剂分开后测结合状态的酶标记物的活性。分开后测结合状态的酶标记物的活性。固相酶免疫测定固相酶免疫测定通过载体将结合状态的酶标记物吸附在固相支持物上，通过载体将结合状态的酶标记物吸附在固相支持物上，只需洗涤就可将游离的酶标记物去除。以只需洗涤就可将游离的酶标记物去除。以ELISAELISA最常用。最常用。酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是在是在免疫酶
8、技术免疫酶技术(immunoenzymaticimmunoenzymatic techniques)techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,可用于测定抗原，也可用于测定抗体可用于测定抗原，也可用于测定抗体 。ELISAELISA的原理的原理将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原抗原抗体反应使抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经上，经洗涤去除游离的洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物从，加入底物显色，
9、定性或定量分析有色产物从而确定待测物的存在与含量。而确定待测物的存在与含量。ELISA过程过程1 1、包被包被抗原抗原(抗体抗体)吸附在固相载体上称为包被。吸附在固相载体上称为包被。2 2、复合物的形成复合物的形成加待测抗体加待测抗体(抗原抗原),),再加相应酶标记抗体再加相应酶标记抗体(抗原抗原),),生成抗原生成抗原(抗体抗体)-)-待测抗体待测抗体(抗原抗原)-)-酶标记抗体酶标记抗体的复合物。的复合物。3 3、酶与该酶底物反应酶与该酶底物反应抗原抗原(抗体抗体)-)-待测抗体待测抗体(抗原抗原)-)-酶标记抗体复合酶标记抗体复合物与该酶的底物反应生成有色产物。物与该酶的底物反应生成有色
10、产物。4 4、检测检测借助分光光度计的光吸收计算抗体借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原抗原)的量。的量。待测抗体待测抗体(抗原抗原)的定量与有色产物成正比。的定量与有色产物成正比。ELISA的试剂的试剂三个必要的试剂：三个必要的试剂：（1 1）固相的抗菌素原（抗原）或抗体，即）固相的抗菌素原（抗原）或抗体，即 “免疫吸附剂免疫吸附剂”（immunosorbentimmunosorbent）；）；（2 2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物结合物”（conjugateconjugate）；）；（3 3）酶反应的）酶反应的底物底物。完整的完整的ELISA试剂盒包含以下各组
11、分：试剂盒包含以下各组分：（2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参 考标准品和控制血清（定量测定中）；考标准品和控制血清（定量测定中）；（5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）酶反应终止液。）酶反应终止液。（1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；1 1免疫吸附剂免疫吸附剂 已包被抗原或抗体的固相载体在低温（已包被抗原或抗体的固相载体
12、在低温（2-82-8）干燥的条件下一般可保存干燥的条件下一般可保存6 6个月。个月。1.11.1固相载体固相载体固相载体在固相载体在ELISAELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。参与化学反应。ELISAELISA载体的形状主要有三种：微载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。国际上标准的微量滴定量滴定板、小珠和小试管。国际上标准的微量滴定板为板为8 81212的的9696孔式。孔式。1.2 1.2 包被的方式包被的方式包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。IgGIgG对聚苯乙烯等固相具有较
13、强的吸附力，其联结对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在多发生在FcFc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用体的包被一般均采用直接吸附法直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。可以采用间接的可以采用间接的捕获包被法捕获包被法，即先将针对该抗原，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。抗原固相化。DNADNA抗原的包被抗原的包被紫外线照射（例如紫外线照射（例如30W30W紫外灯，紫外灯，75cm75cm照射照射
14、1212小时）小时）固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。白等作预包被，也可提高核酸的结合力。用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNADNA脂类物质的包被脂类物质的包被可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的抗心磷脂抗体的ELISAELISA试剂一般采用
15、这种包被方式。试剂一般采用这种包被方式。1.5 1.5 包被的条件包被的条件抗体和蛋白质抗原一般采用抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6pH9.6的碳酸盐缓冲液的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用作为稀释液，也有用pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液及的磷酸盐缓冲液及pH7-8pH7-8的的TrisTris-HCL-HCL缓冲液作为稀释液的。缓冲液作为稀释液的。通常在通常在ELISAELISA板孔中加入包被液后，在板孔中加入包被液后，在4-84-8冰箱中冰箱中放置过夜，放置过夜，3737中保温中保温2 2小时被认为具有同等的包小时被认为具有同等的包被效果。被效果。一般蛋白质的包被浓度为一般蛋白质的包被
16、浓度为100100ngng/ml-20ug/ml/ml-20ug/ml。为防止包被后载体上留有未包被的空隙而导致本底为防止包被后载体上留有未包被的空隙而导致本底过高，常用过高，常用1%-5%BSA1%-5%BSA封闭空隙。封闭空隙。2 2 结合物结合物酶标记的抗体（或抗原），是酶标记的抗体（或抗原），是ELISAELISA中最关键的试剂。中最关键的试剂。良好的结合物应具备：良好的结合物应具备：既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结
17、合试剂中应尽量不含有或少含有未结合的例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有未结合的酶或抗体（或抗原）。酶或抗体（或抗原）。结合物要有良好的稳定性。结合物要有良好的稳定性。2.1酶用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高纯度高，催化反应的转化率高专一性强，性质稳定专一性强，性质稳定来源丰富，价格不贵来源丰富，价格不贵 制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力能力在受检标本中不存在相同的酶在受检标本中不存在相同的酶 它的相应底物易于制备和保存，有色产物易于测定它的相应底物易于制备和保存，有色产物易于测定 在在ELISAELISA
18、中，常用的酶为辣根过氧化物酶中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidasehorseradish peroxidase,HRPHRP)碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosohatasealkaline phosohatase,APAP)。制备结合物时所用抗体一般制备结合物时所用抗体一般 均为纯度较高的均为纯度较高的IgGIgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。在在ELISAELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。是抗原必须是高纯度的。2.3 2.3 结合物的制备
19、结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种酶标记抗体的制备方法主要有两种交联法：可同时与酶和抗体（抗原）结交联法：可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为合的交联剂作为“桥桥”，分别连接酶和，分别连接酶和抗体（抗原）的方法，形成酶抗体（抗原）的方法，形成酶-交联剂交联剂-抗体（抗原）。抗体（抗原）。戊二醛交联法戊二醛交联法 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 直接法：用一活化剂首先将酶活化，被活化的直接法：用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物。形成的标记物为酶成标记物。形成的标记物为酶-抗体（抗原）。抗体（抗原）。过碘酸盐氧
20、化法过碘酸盐氧化法 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶2.42.4结合物的保存结合物的保存需加入蛋白保护剂（蛋白酶抑制剂）需加入蛋白保护剂（蛋白酶抑制剂）再加入抗生素（庆大霉素）和防腐剂再加入抗生素（庆大霉素）和防腐剂HRPHRP结合物加硫柳泵结合物加硫柳泵APAP结合物可加叠氮钠，以防止细菌生长。结合物可加叠氮钠，以防止细菌生长。冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右加入等体积甘油可在低温冰箱或普通冰箱中保存加入等体积甘油可在低温冰箱或普通冰箱中保存较长时间较长时间2.5 2.5 结合物的稀释液结合物的稀释液 为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在为避免结合
21、物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%1%牛牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温子型表面活性剂，如吐温2020，0.05%0.05%的浓度较为适宜。的浓度较为适宜。3 3 酶的底物酶的底物3.1 3.1 HRPHRP的底物的底物 邻苯二胺邻苯二胺(O-phenylenediamineO-phenylenediamine,OPDOPD)HRPHRP最常用的
22、底物最常用的底物 产物呈橙红色，在产物呈橙红色，在492nm492nm处有最高吸收峰处有最高吸收峰OPDOPD见光易变质，须现配置现用。见光易变质，须现配置现用。-四甲基联苯胺四甲基联苯胺(3,3,5,5(3,3,5,5tetramethylbenzidinetetramethylbenzidine,TMBTMB)产物显蓝色，酶反应用产物显蓝色，酶反应用HCLHCL或或H2SO4H2SO4终止后，产物由蓝终止后，产物由蓝色色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450450nmnm。3-(4-3-(4-羟基羟基)苯丙酸苯丙酸3-(4-3-(4-hydr
23、oxy)phenly propionichydroxy)phenly propionic acid,acid,HPPAHPPA 经经HRPHRP作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量（定作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量（定量）或放射自显影（定性）。量）或放射自显影（定性）。3.23.2APAP的底物的底物对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylp-nitrophenyl phosphate,phosphate,p-NPPp-NPP)产物为黄色的对硝基酚，产物为黄色的对硝基酚，在在405nm405nm波长处有吸收峰。波长处有吸收峰。用用NaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳
24、定一时间终止酶反应后，黄色可稳定一时间磷酸磷酸4-4-甲基伞酮甲基伞酮 可发荧光的底物，用于可发荧光的底物，用于ELISAELISA作荧光测定，敏感度较高作荧光测定，敏感度较高4 4 洗涤液洗涤液 在板式在板式ELISA中，常用的洗涤液为含中，常用的洗涤液为含0.05%0.05%吐温吐温2020的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液。5 5 酶反应终止液酶反应终止液常用的常用的HRPHRP反应终止液为硫酸，反应终止液为硫酸，在板式在板式ELISA中一般采用中一般采用2 2mol/Lmol/LELISAELISA的类型的类型一）双抗体夹心法测抗原一）双抗体夹心法测抗原利用待测抗原上的两个抗原决定簇利用待测
25、抗原上的两个抗原决定簇A A和和B B分别与分别与固相载体上的抗体固相载体上的抗体A A和酶标记抗体和酶标记抗体B B结合，形成结合，形成抗体抗体A-A-待测抗原待测抗原-酶标抗体酶标抗体B B复合物，复合物的复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属于非竞争性形成量与待测抗原含量成正比，属于非竞争性反应。反应。抗体抗体固相抗体固相抗体保温保温受检标本受检标本抗原抗原洗涤洗涤酶标抗体酶标抗体抗体抗体酶标酶标洗洗涤涤加加底底物物保温保温洗涤洗涤 此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能不适用于测定半抗原及
26、小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。形成两位点夹心。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RFRF）的干扰。采用）的干扰。采用F F（abab）或）或FabFab片段作酶结合片段作酶结合物物的试剂，由于去除了的试剂，由于去除了FcFc段，从而消除段，从而消除RFRF的干扰。的干扰。抗体的选择：如抗体的来源为抗血清，包被和抗体的选择：如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。二）二）间接法测抗体间接法测抗体原理为将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体原理为将已知抗原连接在固相载体上
27、，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测待测抗体抗体-酶标二抗的复合物，复合物的量与待测抗体酶标二抗的复合物，复合物的量与待测抗体量成正比，也属于非竞争性反应。量成正比，也属于非竞争性反应。抗原抗原固相抗原固相抗原洗涤洗涤受检血清受检血清抗体抗体洗涤洗涤酶标抗抗体酶标抗抗体抗抗体抗抗体酶标酶标洗洗涤涤加加底底物物保温保温保温保温主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性度的非特异性IgGIgG ，
28、非特异，非特异IgGIgG可直接吸附到固相可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（BSABSA）再包被一次，以封闭（再包被一次，以封闭（blockingblocking）固相上的空余间）固相上的空余间隙。在检测过程中标本须先行稀释（隙。在检测过程中标本须先行稀释（1:401:401:2001:200），以避免过高的阴性本底），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。影响结果的判断。三）三）竞争法竞争法可用于检测抗原和抗体。用酶标抗原（抗体）与待可用于检测抗原和抗体。用
29、酶标抗原（抗体）与待测测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非非标记复合物多，酶标复合物就少，故显色程度与待标记复合物多，酶标复合物就少，故显色程度与待测测物含量成反比。物含量成反比。小分子激素、药物等小分子激素、药物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量 四）四）捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体 在在临床检验中测定抗体临床检验中测定抗体IgMIgM时多采用捕获包被
30、法。时多采用捕获包被法。抗人抗人IgMIgM固相抗体的形成固相抗体的形成加入血清标本，形成加入血清标本，形成抗人抗人IgMIgM固相抗体固相抗体-特异性特异性IgMIgM抗抗体体复合物复合物加入抗原，形成加入抗原，形成抗人抗人IgMIgM固相抗体固相抗体-特异性特异性IgMIgM抗抗体体-抗原抗原复合物。复合物。加酶标记针对抗原的特异性抗体，形成加酶标记针对抗原的特异性抗体，形成抗人抗人IgMIgM固相固相抗体抗体-特异性特异性IgMIgM抗体抗体-抗原抗原-酶标抗体酶标抗体复合物。复合物。酶再与底物作用，呈色即与标本中的酶再与底物作用，呈色即与标本中的IgMIgM成正相关。成正相关。此法常用
31、于病毒性感染的早期诊断。此法常用于病毒性感染的早期诊断。ELISAELISA常用技术类型比较常用技术类型比较类型类型固相载固相载体上的体上的包被物包被物待测待测物物酶标记物酶标记物显色程度显色程度与待测物与待测物含量间的含量间的关系关系双抗体夹心法双抗体夹心法（一步法）（一步法）抗体抗体A抗原抗原酶标抗体酶标抗体B正相关正相关间接法间接法抗原抗原抗体抗体酶标二抗酶标二抗正相关正相关竞争法竞争法抗原抗原（抗体）（抗体）抗体抗体（抗原）（抗原）酶标抗体酶标抗体（抗原）（抗原）负相关负相关捕获法捕获法抗抗IgMIgM酶标抗体酶标抗体正相关正相关ELISAELISA的操作要点的操作要点1 1 标本的采
32、取和保存标本的采取和保存广泛：体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物广泛：体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便），大部分检测以血清为标本。（如尿液、粪便），大部分检测以血清为标本。5 5天内测定的血清，天内测定的血清，44，超过一周，超过一周，低温冰存低温冰存。冻结血清融解后，应充分混匀，避免气泡冻结血清融解后，应充分混匀，避免气泡 。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。检测。测抗体的血清如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。测抗体的血清如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。3 加样2 2 试剂的准备试剂的准备按试剂盒说
33、明书的要求准备实验中需用的试剂。按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。从冰箱中取出的试剂应待温度与室温平衡后使用。从冰箱中取出的试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不用的部分应及时放回冰箱保存。试剂盒中本次试验不用的部分应及时放回冰箱保存。一般有一般有3 3次加样，即加标本，加酶结合物，加底物。次加样，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避免加板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。4 4 保温（温育）保温（温育）常采用常采用4343、3737、室温和、
34、室温和44（冰箱温度）等。（冰箱温度）等。3737是常用的保温温度。是常用的保温温度。也采用也采用44过夜，抗原抗体反应过夜，抗原抗体反应44更为彻底。更为彻底。一般采用水浴，将一般采用水浴，将ELISAELISA板置于水浴箱中，板置于水浴箱中，ELISAELISA板底应板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。板漂浮在水面上。5 5 洗涤洗涤通过洗涤来达到分离通过洗涤来达到分离游离的游离的和和结合的结合的酶标酶标记物的目的
35、。记物的目的。洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊的自动仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。浸泡式浸泡式 a.a.吸干或甩干孔内反应液；吸干或甩干孔内反应液；b.b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-21-2分钟，间歇摇动，分钟，间歇摇动，d.d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾
36、或吸水纸上拍干；也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.e.重复操作重复操作c c和和d d，洗涤，洗涤3-43-4次（或按说明规定）。次（或按说明规定）。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。6 6 显色和比色显色和比色OPDOPD底物显色在室温或底物显色在室温或3737反应反应20-3020-30分钟后分钟后即不再加深，即不再加深，OPDOPD产物用硫酸终止后，显色由产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。橙黄色转向棕黄色。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达顶峰，分钟显色达顶峰，TMBTMB的终止液有多种，叠氮
37、钠和十二烷基硫酸钠的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDSSDS）能使蓝色维持较长时间（）能使蓝色维持较长时间（12-2412-24小时）小时）是目视判断的良好终止剂。酸性终止液则会使是目视判断的良好终止剂。酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450450nmnm）测读吸光值。测读吸光值。比色比色拭干板底附着的液体，正确放入酶标比色仪的比色架中拭干板底附着的液体，正确放入酶标比色仪的比色架中蒸馏水校零点蒸馏水校零点比色结果的表达用光密度（比色结果的表达用光密度（oplicaloplical density density，ODOD），）
38、，或吸光度（或吸光度（absorbenceabsorbence，A A），两者含义相同。），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于通常的表示方法是，将吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波长为的吸收波长为492nm492nm，表示方法为，表示方法为A492nmA492nm或或 OD492nmOD492nm。吸光度减去空白孔的吸光度，然后进行计算吸光度减去空白孔的吸光度，然后进行计算酶标比色仪酶标比色仪 酶标仪，专用于测读酶标仪，专用于测读ELISAELISA结果吸光度的光度计。酶标仪结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复
39、性的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到一般可精确到0.0010.001，准确性为，准确性为1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.0000.0002.9002.900，而其线性范围仅而其线性范围仅0.0000.0002.0002.000，这在定量，这在定量ELISAELISA中制作中制作标准曲线时应予注意
40、。标准曲线时应予注意。结果判断结果判断 1 1 定性测定定性测定对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有有”或或“无无”的的简单回答，分别用简单回答，分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示表示在间接法和夹心法在间接法和夹心法ELSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法在竞争法ELISAELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。2 2 定量测定定量测定定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。在相同的条
41、件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法测定大分子量物质的夹心法ELISAELISA，标准曲线的范围一般较，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近宽，曲线最高点的吸光度可接近2.02.0，绘制时常用半对数纸，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈值逐点连接，所得曲线一般呈S S形，其头、尾部曲线趋于平形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检测定小分子量物
42、质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。物质的浓度呈负相关。ELISAELISA测定的标准曲线示例见图。测定的标准曲线示例见图。注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。酶免疫技术的发展酶免疫技术的发展斑点斑点-ELISAELISA原理同原理同ELISAELISA区别：用对蛋白质有极强吸附力的硝酸纤维素膜代替塑区别：用对蛋白质有极强吸附力的硝酸纤维素膜代替塑料制品作为固相载体，在料制品作为固相载体，在NCNC膜上形成有色沉淀而显色。膜上形成有色沉淀而显色。免疫印迹法免疫印迹法电泳、转印、酶免疫测定电泳、转印、酶免疫
43、测定发光酶免疫测定发光酶免疫测定酶催化的底物是发光剂，产物是发光产物。酶催化的底物是发光剂，产物是发光产物。需用特定的仪器测定需用特定的仪器测定HRPHRP的发光底物有：鲁米诺及衍生物、对的发光底物有：鲁米诺及衍生物、对-羟基苯乙酸羟基苯乙酸APAP的发光底物有：的发光底物有：3-3-（2-2-螺旋金刚烷）螺旋金刚烷）-4-4-甲氧基甲氧基-（3-3-磷酸氧基）磷酸氧基）-苯基苯基-1-1；2-2-二氧乙烷；二氧乙烷；4-4-甲基伞形甲基伞形酮磷酸盐酮磷酸盐BAS-ELISABAS-ELISA法法生物素生物素(biotin)(biotin)是一种小分子生长因子，有两个环状结构，是一种小分子生长
44、因子，有两个环状结构，一个可和亲和素结合，另一个可和包括酶、抗原（抗体）的多一个可和亲和素结合，另一个可和包括酶、抗原（抗体）的多种物质结合。种物质结合。亲和素亲和素(avidinavidin)又称卵白素，有又称卵白素，有4 4个亚基，都可与生物素稳定个亚基，都可与生物素稳定结合，一个亲和素可与结合，一个亲和素可与4 4个生物素分子结合，这样就可放大抗个生物素分子结合，这样就可放大抗原抗体的反应。现在多用从链霉菌中提取的链霉亲和素。原抗体的反应。现在多用从链霉菌中提取的链霉亲和素。亲和素也可被酶标记。亲和素也可被酶标记。以游离亲和素为以游离亲和素为“桥桥”，分别连接生物素化抗原抗体系统，分别连接生物素化抗原抗体系统和和酶标生物素。分为：酶标生物素。分为：BABBAB法和法和ABCABC法法直接用标记亲和素连接生物素化抗原抗体反应系统。有直接用标记亲和素连接生物素化抗原抗体反应系统。有BABA法法双抗夹心法测抗原为例双抗夹心法测抗原为例BABBAB法：固相抗体法：固相抗体+待测抗原待测抗原+抗体抗体-生物素生物素+亲和素亲和素+生物素生物素-酶酶+底物底物ABCABC法：固相抗体法：固相抗体+待测抗原待测抗原+抗体抗体-生物素生物素+亲和素亲和素+生物素生物素-酶酶-底物底物BABA法：固相抗体法：固相抗体+待测抗原待测抗原+抗体抗体-生物素生物素+亲和素亲和素-酶酶 +底物底物
