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免疫扩散技术-IgG测定课件.ppt

1、实验原理以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体的间接凝集试验间接凝集试验:聚苯乙烯颗粒具有很强的吸附蛋白质的能力,借此将抗原(变性IgG)与胶乳颗粒结合成致敏颗粒,直接与待测标本中的抗体(RF)发生凝集反应。RF为抗变性IgG的抗体,因此本实验使用的是人IgG致敏的聚苯乙烯颗粒。试剂和器材 RF检测试剂(商品化试剂)RF阴性血清和阳性血清(试剂盒自带)黑色反应板、滴管、搅拌棒等操作方法1.在黑色反应板上取3格,用滴管分别加待测血清、阳性血清和阴性血清各1滴,然后每格加入1滴致敏胶乳颗粒试剂。2.用搅拌棒充分混匀后,连续摇动23min后与对照比较,观察结果。结果判断 胶乳颗粒凝集且液体澄清者为阳性,胶乳颗粒不

2、凝集仍保持均匀胶乳状者为阴性;首先观察阳性血清和阴性血清的反应结果,若前者为阳性反应后者为阴性反应,说明试剂有效;然后再观察待测样品的反应情况,并判断阴阳性。方法学评价 该试验方法简单、快速、特异性强、结果清晰易观察判断。观察时应注意排除非特异性凝集反应。如何进行半定量分析?实验原理:PEG沉淀法 聚乙二醇(PEG),分子量6000,具有较强的脱水作用,可引起蛋白质沉淀,沉淀具有选择性且对蛋白质生物活性无影响。是免疫浊度测定技术中常用的增浊剂。PEG沉淀蛋白质的选择性与其浓度相关:沉淀蛋白质的选择性与其浓度相关:2%PEG只能沉淀大分子,4%PEG能沉淀较小分子的循环免疫复合物 大于5%PEG

3、,选择性沉淀特性消失。在在PH、离子强度等条件固定时,蛋白质分子量、离子强度等条件固定时,蛋白质分子量越大,用以沉淀的越大,用以沉淀的PEG浓度越小。浓度越小。分离血清免疫复合物一般采用最终浓度为3%4%PEG。血清中加入最终浓度约为3.5%的的PEG后,其浊度与血清中免疫复合物含量相关,用分光光度计测定其A值,代表免疫复合物相对含量。试剂和器材 试剂1:0.1mol/L PH8.6硼酸缓冲液 试剂2:3.75%PEG-硼酸缓冲液 (已备好)(已备好)仪器:721分光光度计 操作方法1.加样:对每一份标本,取两试管按下表操作 加入物(单位:mL)对照管测定管待测血清0.10.1试剂1(硼酸缓冲液)3试剂2(PEG-硼酸缓冲液)3操作方法2.将以上反应管充分混匀,置室温1小时。3.用721分光光度计在460nm波长下混匀测定OD值。4.关机,清洁仪器,盖上布罩。正常参考值:OD0.15 结果易受多种大分子蛋白质的干扰,特异性差。CIC的检出可以为多种与自身免疫相关疾病提供辅助诊断诊断指标,但由于方法上的问题,其测定结果尚不能作为诊断疾病的敏感可靠的指标。要 求1.实验结束后安排同学打扫卫生。2.实验报告与单扩实验分开写,下周上课交报告。

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