1、一，质粒一，质粒DNA的提取的提取 二，基因组二，基因组DNA的提取的提取 限制性内切酶酶切分析限制性内切酶酶切分析 三，三，DNA片段的连接与转化片段的连接与转化 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 凝胶中凝胶中DNA的回收的回收 四，四，RNA的分离纯化的分离纯化 逆转录逆转录PCR 1，质粒，质粒DNA的的提取提取 2，基因组，基因组DNA的的提取提取 3， 限制性内切酶限制性内切酶酶切酶切分析分析 4，DNA片段的片段的连接连接接与转化接与转化 载体，外源载体，外源DNA片段，工具酶，片段，工具酶， 受体细胞受体细胞 质粒质粒DNA的提取及鉴定的提取及鉴定 生物化学与分子生物学系生物
2、化学与分子生物学系 实验目的实验目的 掌握质粒掌握质粒DNA制备的原理和方法制备的原理和方法 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离 Bacterial DNA Plasmids 质粒质粒 实验原理实验原理 细菌悬浮液暴露于细菌悬浮液暴露于NaOH 、SDS 细胞壁破裂，染色体细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性和蛋白质变性 相互缠绕成复合物被相互缠绕成复合物被SDS包裹，当用包裹，当用K+取代取代 Na+时，复合物从溶液中沉淀下来。时，复合物从溶液中沉淀下来。 离心后可从上清中回收质粒离心后可从上清中回收质粒DNA 试试 剂剂 溶液溶液：50 mmol/L葡萄糖、葡萄糖、10m
3、mol/L EDTA、2 5mmol Tris-HCl pH8.0 溶液溶液I：重悬细菌；：重悬细菌； 葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀； TrisHCl：缓冲体系；：缓冲体系； EDTA：螯合金属离子；：螯合金属离子； 溶液溶液II（新鲜配制）（新鲜配制）: 1mol/L NaOH 200 l、 10% SDS 100 l、H2O 700 l 溶液溶液II破膜，变性基因组破膜，变性基因组DNA和蛋白质；和蛋白质； SDS破膜作用，变性蛋白质；破膜作用，变性蛋白质； NaOH破膜，变性基因组破膜，变性基因组DNA 溶液溶液 III : 29.4g KAc、11.5
4、ml冰醋酸、加水至冰醋酸、加水至 100ml 溶液溶液III中和溶液，复性质粒中和溶液，复性质粒DNA 酚酚/ /氯仿（氯仿（1:11:1） 分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。 吸取时不要震荡。吸取时不要震荡。 酚酚变性蛋白质；变性蛋白质； 氯仿氯仿萃取溶液中的酚；萃取溶液中的酚； 乙醇乙醇 无水乙醇（无水乙醇（2 2倍体积）倍体积）沉淀质粒沉淀质粒DNADNA； 70%70%乙醇乙醇洗涤质粒洗涤质粒DNADNA沉淀，除去沉沉淀，除去沉 淀中的盐分；淀中的盐分； 实验流程实验流程 细菌于细菌于LB培养基中培养过夜，分装（培养基中培养过夜，分装（
5、1ml/ 支），支），4000rpm离心离心2min，弃上清。，弃上清。 沉淀重悬于沉淀重悬于100 l溶液溶液中中, 震荡震荡混匀。混匀。 加入加入200 l新鲜配制新鲜配制的溶液的溶液，颠倒颠倒混匀。混匀。 （此步骤时间不宜过长）（此步骤时间不宜过长） 加入加入150 l溶液溶液，颠倒颠倒混匀，冰浴混匀，冰浴5min， 12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入等体积饱和等体积饱和 酚酚（约（约450 l），颠倒混匀，），颠倒混匀，12000rpm 离心离心 10min。 实验流程实验流程 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管
6、中，加入等体积酚等体积酚/氯氯 仿仿，颠倒颠倒混匀，混匀，12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入2倍体积冷无倍体积冷无 水乙醇水乙醇混匀，静置混匀，静置5min，12000rpm离心离心10min。 弃上清，用弃上清，用0.5ml 70% 乙醇洗涤乙醇洗涤DNA，弃上清，弃上清， 倒置干燥。倒置干燥。 加入加入10 l TE，1%琼脂糖凝胶电泳观察。琼脂糖凝胶电泳观察。 TE 10ul 6x loading buffer 2ul DNA染料 1ul 核酸的定量核酸的定量 260 nm， 1OD值相当于：值相当于： 双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml 单链单链DNA浓度为浓度为40 g/ml A260/A280 = 1.8（DNA） A260/A280 = 2.0（RNA） 电泳鉴定电泳鉴定 其中其中超螺旋结构超螺旋结构泳动最快；泳动最快； 其次为其次为开环结构开环结构； 最慢的可能是最慢的可能是复制中间体复制中间体（没有复制完（没有复制完 的两个质粒连在一起）；的两个质粒连在一起）；
