1、一,质粒一,质粒DNA的提取的提取 二,基因组二,基因组DNA的提取的提取 限制性内切酶酶切分析限制性内切酶酶切分析 三,三,DNA片段的连接与转化片段的连接与转化 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 凝胶中凝胶中DNA的回收的回收 四,四,RNA的分离纯化的分离纯化 逆转录逆转录PCR 1,质粒,质粒DNA的的提取提取 2,基因组,基因组DNA的的提取提取 3, 限制性内切酶限制性内切酶酶切酶切分析分析 4,DNA片段的片段的连接连接接与转化接与转化 载体,外源载体,外源DNA片段,工具酶,片段,工具酶, 受体细胞受体细胞 质粒质粒DNA的提取及鉴定的提取及鉴定 生物化学与分子生物学系生物
2、化学与分子生物学系 实验目的实验目的 掌握质粒掌握质粒DNA制备的原理和方法制备的原理和方法 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离 Bacterial DNA Plasmids 质粒质粒 实验原理实验原理 细菌悬浮液暴露于细菌悬浮液暴露于NaOH 、SDS 细胞壁破裂,染色体细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性和蛋白质变性 相互缠绕成复合物被相互缠绕成复合物被SDS包裹,当用包裹,当用K+取代取代 Na+时,复合物从溶液中沉淀下来。时,复合物从溶液中沉淀下来。 离心后可从上清中回收质粒离心后可从上清中回收质粒DNA 试试 剂剂 溶液溶液:50 mmol/L葡萄糖、葡萄糖、10m
3、mol/L EDTA、2 5mmol Tris-HCl pH8.0 溶液溶液I:重悬细菌;:重悬细菌; 葡萄糖:比重大,使细菌不易沉淀;葡萄糖:比重大,使细菌不易沉淀; TrisHCl:缓冲体系;:缓冲体系; EDTA:螯合金属离子;:螯合金属离子; 溶液溶液II(新鲜配制)(新鲜配制): 1mol/L NaOH 200 l、 10% SDS 100 l、H2O 700 l 溶液溶液II破膜,变性基因组破膜,变性基因组DNA和蛋白质;和蛋白质; SDS破膜作用,变性蛋白质;破膜作用,变性蛋白质; NaOH破膜,变性基因组破膜,变性基因组DNA 溶液溶液 III : 29.4g KAc、11.5
4、ml冰醋酸、加水至冰醋酸、加水至 100ml 溶液溶液III中和溶液,复性质粒中和溶液,复性质粒DNA 酚酚/ /氯仿(氯仿(1:11:1) 分为两层,上层为水层,下层为酚氯仿混合液。分为两层,上层为水层,下层为酚氯仿混合液。 吸取时不要震荡。吸取时不要震荡。 酚酚变性蛋白质;变性蛋白质; 氯仿氯仿萃取溶液中的酚;萃取溶液中的酚; 乙醇乙醇 无水乙醇(无水乙醇(2 2倍体积)倍体积)沉淀质粒沉淀质粒DNADNA; 70%70%乙醇乙醇洗涤质粒洗涤质粒DNADNA沉淀,除去沉沉淀,除去沉 淀中的盐分;淀中的盐分; 实验流程实验流程 细菌于细菌于LB培养基中培养过夜,分装(培养基中培养过夜,分装(
5、1ml/ 支),支),4000rpm离心离心2min,弃上清。,弃上清。 沉淀重悬于沉淀重悬于100 l溶液溶液中中, 震荡震荡混匀。混匀。 加入加入200 l新鲜配制新鲜配制的溶液的溶液,颠倒颠倒混匀。混匀。 (此步骤时间不宜过长)(此步骤时间不宜过长) 加入加入150 l溶液溶液,颠倒颠倒混匀,冰浴混匀,冰浴5min, 12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中,加入管中,加入等体积饱和等体积饱和 酚酚(约(约450 l),颠倒混匀,),颠倒混匀,12000rpm 离心离心 10min。 实验流程实验流程 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中,加入管
6、中,加入等体积酚等体积酚/氯氯 仿仿,颠倒颠倒混匀,混匀,12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中,加入管中,加入2倍体积冷无倍体积冷无 水乙醇水乙醇混匀,静置混匀,静置5min,12000rpm离心离心10min。 弃上清,用弃上清,用0.5ml 70% 乙醇洗涤乙醇洗涤DNA,弃上清,弃上清, 倒置干燥。倒置干燥。 加入加入10 l TE,1%琼脂糖凝胶电泳观察。琼脂糖凝胶电泳观察。 TE 10ul 6x loading buffer 2ul DNA染料 1ul 核酸的定量核酸的定量 260 nm, 1OD值相当于:值相当于: 双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml 单链单链DNA浓度为浓度为40 g/ml A260/A280 = 1.8(DNA) A260/A280 = 2.0(RNA) 电泳鉴定电泳鉴定 其中其中超螺旋结构超螺旋结构泳动最快;泳动最快; 其次为其次为开环结构开环结构; 最慢的可能是最慢的可能是复制中间体复制中间体(没有复制完(没有复制完 的两个质粒连在一起);的两个质粒连在一起);