1、 重组重组DNADNA技术技术Recombinant DNA technologyRecombinant DNA technology( (基因工程基因工程Genetic Engineering)Genetic Engineering)第二十一章第二十一章1. 化学合成法化学合成法要求：已知核苷酸序列或氨基酸序列要求：已知核苷酸序列或氨基酸序列 。2. 基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)（一）化学合成法获取目的基因（一
2、）化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。 基因组基因组DNA (genomic DNA，gDNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体染色体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。 （二）从基因组（二）从基因组DNA文库获取目的基因文库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应
3、 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核用随机切割的真核生物染色体生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 gDNA文库构建文库构建AAAAAAAAAATTTTTTTTTTT逆转录酶逆转录酶Klenow片段片段cDNA (complementary DNA)（三）从（三）从cDNAcDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受
4、体菌 复制复制逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T 人工突变人工突变 （四）通过（四）通过PCRPCR获取目的基因获取目的基因 Agarose Gel ElectrophoresisGel Extraction and DNA Recovery携带目的基因，实现其携带目的基因，实现其繁殖繁殖或或表达表达所用的所用的DNA。克隆载体克隆载体(cloning vector)使外源使外源DNA被被扩增扩增表达载体表达载体(expression vector)使外源使外源DNA可可转录翻译转录翻译成成 多肽链多肽链
5、载体的选择标准：载体的选择标准：能自主复制；能自主复制；具有遗传标记，便于筛选和鉴定；具有遗传标记，便于筛选和鉴定；有多克隆位点（外源有多克隆位点（外源DNA插入点；插入点；容纳较大外源容纳较大外源DNA。（一）质粒（一）质粒 (plasmid)(plasmid)特点特点: : 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）（二）（二） 噬菌体噬菌体(phage) (phage) M13噬菌体
6、噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因） 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（三）其他载体（三）其他载体常用工具酶常用工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶
7、聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键，使使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DN
8、A聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，第二链合成，双链双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCC
9、TAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)识别识别DNA特异序列特异序列, 并在识别位点或周围切割双链并在识别位点或周围切割双链DNA的内切酶。的内切酶。酶酶 切切 反反 应应 的的 基基 本本 步步 骤骤电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同
10、一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接1. 粘性末端连接粘性末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGG
11、CCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情
12、况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连2. 平端连接平端连接 5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA
13、 T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5 3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco R4. 人工接头人工接头(linker)连接连接连接反应的条件连接反应的条件 酶最适温度为酶最适温度为3737，但此时氢键不够稳定，且酶活会迅速降，但此时氢键不够稳定，且酶活会迅速降低。通常在低。通常在4-154-15连接。连接。影响因素：影响因素：A. A. 温度（最主要的因素）温度（最主要的因素）B. ATPB. ATP的浓度的浓度C. C. 连接酶浓度连接酶浓度D. D. 反应时间反应时间E. E. 插入片段和载体片段插入
14、片段和载体片段 的摩尔比的摩尔比转化4 过夜加反应液CK-CK-重组菌落重组菌落CK+CK+转化转化 (transformation，DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌)转染转染 (transfection，DNA导入真核细胞，酵母除导入真核细胞，酵母除外外)感染感染 (infection，噬菌体、病毒感染细胞，噬菌体、病毒感染细胞)1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择ampr、tetr 、Kanr(2) 标志补救标志补救(marker rescue)， 如如互补互补(3) 分子杂交法分子杂交法2. 免疫学方法（非直接选择法）免疫学方法（非直接选择法）如免疫化学方法及酶免
15、检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等( (插入失活法插入失活法) ) 抗药性标记选择抗药性标记选择 互补互补 原位杂交原位杂交鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法免疫学方法 小结小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的技术操作的主要步骤主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基
16、因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交构建构建表达表达载体载体受体细胞受体细胞产物的分离纯化产物的分离纯化 选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列 多接头克隆位点多接头克隆位点1. 原核表达体系原核表达体系 (E.coli最常用最常用)缺乏翻译后加工机制，不宜表达缺乏翻译后加工机制，不宜表达gDNA；缺乏翻译后加工机制，不能加工真核蛋白；缺乏翻译后加工机制，不能加工真核蛋白；蛋白常形成包涵体蛋白常形成包涵体(inclusion body) ；
17、需要复杂处；需要复杂处理方能具有活性。理方能具有活性。很难表达大量可溶性蛋白。很难表达大量可溶性蛋白。不足不足大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：缺点：操作技术难、费时、不经济操作技术难、费时、不经济2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）重组人胰岛素重组人胰岛素生物制药生物制药 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素
18、原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱
