1、补体依赖的细胞毒实验补体依赖的细胞毒实验 Complement-dependent cytotoxicity补体的作用和激活途径补体的作用和激活途径v补体的作用补体的作用 溶菌和溶细胞 促进中和溶解病毒 调理吞噬 炎症介质v补体的激活途径补体的激活途径 经典途径 旁路途径 MBL途径本次实验目的本次实验目的1掌握细胞毒实验掌握细胞毒实验的原理的原理2补体依赖细胞毒实补体依赖细胞毒实验基本操作步骤验基本操作步骤3了解补体依赖细胞了解补体依赖细胞毒实验的应用毒实验的应用 实验原理实验原理+ 补体台盼蓝染液台盼蓝染液抗原与抗体结合补体依赖细胞毒实验的应用补体依赖细胞毒实验的应用v检查细胞膜抗原检查细
2、胞膜抗原v鉴定抗体的特异性鉴定抗体的特异性v微量淋巴细胞毒试验微量淋巴细胞毒试验 检测人体的组织相容性检测人体的组织相容性v选择性地去除某一细胞亚群选择性地去除某一细胞亚群实验主要材料实验主要材料1. 小鼠2. 抗血清（ ）3. 补体：新鲜豚鼠血清（补）4. 磷酸盐缓冲液（ PBS ） ，载玻片、盖玻片、一次性移液管5. 台盼蓝染色液台盼蓝染色液 (于讲台上取于讲台上取)实验材料实验材料需要回收的：需要回收的：清洗完交至讲台处由老师检查：剪刀、镊子、筛网(200目)、玻璃培养皿、 研磨棒。操作步骤操作步骤一、小鼠胸腺/脾脏细胞悬液的制备 46周龄小鼠断颈处死，取出胸腺/脾脏放至含有13 mL
3、PBS的平皿中，以剪刀和镊子将组织处理成单细胞悬液。胸腺注意事项：注意事项： 小鼠断颈要迅速、彻底，以防小鼠挣扎过程中出血过多，也可事小鼠断颈要迅速、彻底，以防小鼠挣扎过程中出血过多，也可事先摘眼球放血。先摘眼球放血。脾脏脾脏操作步骤操作步骤 振荡混匀，置振荡混匀，置37 C水浴箱，水浴箱，10min 振荡混匀，置振荡混匀，置37 C水浴箱，水浴箱，20min 各加各加50ul 0.4%台盼蓝，混匀后立即镜下观察台盼蓝，混匀后立即镜下观察 振荡混匀，滴片加盖玻片，镜检振荡混匀，滴片加盖玻片，镜检Ag+Abcomplement二、细胞毒实验： 按下表加样PBS/脾脏细胞结果观察结果观察 台盼蓝染色：台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝。 如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有意义。AB A. 对照组对照组 B. 实验组实验组注意事项：注意事项： 台盼蓝染色后放置时间不能太长，台盼蓝染色后放置时间不能太长，2-5min之内观察结果，否则出现之内观察结果，否则出现假阳性，需要重新染色。假阳性，需要重新染色。计算杀伤率：在高倍镜下计数200个细胞中死细胞的百分率
