1、24.1反义技术简介反义技术简介24.2反义核酸类药物的特点反义核酸类药物的特点24.3反义核酸类药物的作用机理及应用反义核酸类药物的作用机理及应用24.4反义核酸类药物的通用生产方法与技术反义核酸类药物的通用生产方法与技术24.5典型反义核酸类药物生产技术及工艺典型反义核酸类药物生产技术及工艺24.6反义类药物的发展前景与展望反义类药物的发展前景与展望 何谓何谓“反义反义”靶是有靶是有“正义正义”的链的链反义核酸与靶结合，为了区分，把反义核酸与靶结合，为了区分，把补充进的链定义为补充进的链定义为“反义反义” 反义核酸是指与具有遗传信息的反义核酸是指与具有遗传信息的“正义正义”（POSITIV
2、E SENSE）核酸链互补的核酸序列，与靶基因具有互补序列的）核酸链互补的核酸序列，与靶基因具有互补序列的DNADNA或或RNARNA片段，可通过碱基互补配对原则原理与特定靶基因片段，可通过碱基互补配对原则原理与特定靶基因或或MRNAMRNA形成杂交链，从而阻断基因转录和翻译。它包括反义形成杂交链，从而阻断基因转录和翻译。它包括反义RNARNA、反义、反义DNADNA及核酶（及核酶（RIBOZYME），可通过人工合成和从），可通过人工合成和从生物中提取获得它们。生物中提取获得它们。24.1反义技术简介反义技术简介反义技术（反义技术（antisense technology）就是采用反义核就是采
3、用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因的技术酸分子抑制、封闭或破坏靶基因的技术。 发展史发展史History时间时间/ /年年事件事件人或机构人或机构1953首次提出首次提出“反义反义”定义定义Watson1957三螺旋核酸概念的提出三螺旋核酸概念的提出Davies1969第一代反义核酸药物（福米韦生，第一代反义核酸药物（福米韦生，Fomivirsen）诞生）诞生Isis制药公司制药公司1978首次应用合成的寡核苷酸成功的抑制基因的表达首次应用合成的寡核苷酸成功的抑制基因的表达Zamenick和和Stephenson1980ColE1 DNA复制研究中发现反义调节机制复制研究中发现反义调节机制I
4、toh和和Tomizawa1981第二代反义核酸药物第二代反义核酸药物Hybridon公司公司1984首次提出反义核酸可用于下调原核生物与真核生物基因的表达首次提出反义核酸可用于下调原核生物与真核生物基因的表达Coleman等等1987首次报道反义链下调一种细菌基因的表达首次报道反义链下调一种细菌基因的表达Rothstein1988首次报道反义基因下调一种植物基因的表达首次报道反义基因下调一种植物基因的表达Van der Krol1988一段一段27bp的三链结构寡核苷酸序列特异性抑制的三链结构寡核苷酸序列特异性抑制c-myc的转录的转录Cooey1990首次报道正义基因下调植物基因的表达首次
5、报道正义基因下调植物基因的表达Napoli和和Van der Krol1997反义反义P120抑制抑制MIA Pa Ca-2细胞细胞Freeman 反义技术的两种技术路线反义技术的两种技术路线将表达与体内基因或将表达与体内基因或mRNA互补序列的互补序列的基因转入体内，使细胞表达与目标基因基因转入体内，使细胞表达与目标基因互补的互补的mRNA，从而阻断目标基因的表从而阻断目标基因的表达达体外合成体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进入细胞，特异性通过静脉注射等途径进入细胞，特异性的与目标的与目标mRNA作用作用以第二种为主来介绍以第二种为主来介绍 反义基因
6、药物输送系统反义基因药物输送系统脂质体、脂质复合物脂质体、脂质复合物受体介导的转移技术受体介导的转移技术以聚合物微球为载体的输送系统以聚合物微球为载体的输送系统 树枝状高聚物树枝状高聚物 脂质体、脂质复合物脂质体、脂质复合物脂质体是由磷脂双脂质层包裹液体脂质体是由磷脂双脂质层包裹液体成分构成成分构成 阳离子脂质体和阳离子脂质体和ASODN形成阳离子形成阳离子脂质复合物与带有负电荷的细胞膜脂质复合物与带有负电荷的细胞膜亲和，通过胞饮进入细胞内亲和，通过胞饮进入细胞内 受体介导的转移技术受体介导的转移技术:受受体介导受受体介导DNA转运技术的转运技术的启发实现启发实现DNA和和RNA的转运的转运
7、例例:脱唾液酸血清类粘蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白(ASGP)受体受体脱去血清类粘蛋白上的唾液酸，得到脱去血清类粘蛋白上的唾液酸，得到ASGP以中间连接物将以中间连接物将ASGP与多聚赖氨酸与多聚赖氨酸 （PL）共价结合，得到共价结合，得到ASGPPL复合物复合物结合反义结合反义RNA，成为成为ASGPPL反义反义RNA复合物复合物 该复合物能被肝细胞表面该复合物能被肝细胞表面ASGP受体识别，吞噬，然后受体识别，吞噬，然后释放，发挥作用释放，发挥作用 受体介导的转移技术：受体介导的转移技术：有以下两个优点：有以下两个优点： 1. 专一性强专一性强 2. 抗降解能力强抗降解能力强 以聚合物微球为载
8、体的输送系统以聚合物微球为载体的输送系统 目前研究最多的聚合物微球是聚丙交酯目前研究最多的聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羟乙酸（及乳酸一羟乙酸（LA-GA）以丙交酯和乙交酯为单体形成的共聚物，以丙交酯和乙交酯为单体形成的共聚物，降解属于水解反应，产物均为人体正常降解属于水解反应，产物均为人体正常代谢物，降解时间取决于两种单体的配代谢物，降解时间取决于两种单体的配比和聚合物的分子量，构成的结合复合比和聚合物的分子量，构成的结合复合体具有潜在的转运反义核苷酸和核酶的体具有潜在的转运反义核苷酸和核酶的作用作用 树枝状高聚物树枝状高聚物 转运带负电荷的转运带负电荷的ASODN，并形并形成稳定的复合物成稳
9、定的复合物 第一种第一种ASODN药物药物-Vitravene98年，第一种年，第一种ASODN药物由药物由FDA批准批准使用使用用于治疗一种由用于治疗一种由CMV（巨细胞病毒）引巨细胞病毒）引起的眼部传染病起的眼部传染病-巨细胞病毒性视网巨细胞病毒性视网膜炎膜炎流行于艾滋病人中流行于艾滋病人中 巨细胞病毒性视网膜炎巨细胞病毒性视网膜炎把药物把药物注射到玻璃体中，然后被注射到玻璃体中，然后被视网膜中的受染细胞吸收，进入视网膜中的受染细胞吸收，进入细胞的细胞的ASODN与病毒的与病毒的mRNA结合结合24.2反义核酸类药物的特点反义核酸类药物的特点根据核酸杂交原理根据核酸杂交原理来来设计，针对特
10、设计，针对特定靶序列定靶序列人工合成人工合成DNA或或RNA小分子小分子由由7到到30个核苷酸组成个核苷酸组成 功能：功能： 有选择地结合目标，影响转录或有选择地结合目标，影响转录或翻译，促进结合产物的降解翻译，促进结合产物的降解分类：分类： 反义反义DNA，反义反义RNA（核酶）核酶）反义核酸类药物的特点：反义核酸类药物的特点： 高度特异性高度特异性 高效低毒高效低毒 最优化药物设计最优化药物设计 经济方便经济方便 24.3反义核酸类药物的作用反义核酸类药物的作用机理及应用机理及应用 反义寡聚核苷酸反义寡聚核苷酸 & 反义寡聚脱氧核苷酸反义寡聚脱氧核苷酸反义寡聚核苷酸反义寡聚核苷酸Antis
11、ense oligonucleotides mRNA 翻译 蛋白质反义反义RNA作用机理作用机理前体-mRNADNA转录mRNA翻译蛋白质反义寡脱氧核苷酸抑制mRNA翻译：a：RNA与核糖体作用的空间位阻；b：阻碍mRNA从核内到细胞质的通道；c：与目标序列结合；d：RNase H酶裂解目标mRNA 根据反义根据反义RNA的作用机制分为的作用机制分为 类反义类反义RNA直接作用于靶直接作用于靶mRNA的的S D序列和序列和(或或)部分编码区，直接抑制翻译，或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶与靶mRNA结合形成双链结合形成双链RNA，从而易被从而易被RNA酶酶 降解；降解； 类反义类反义RNA与
12、与mRNA的非编码区结合，的非编码区结合，引起引起mRNA构象变化，抑制翻译；构象变化，抑制翻译； 类反义类反义RNA则直接抑制靶则直接抑制靶mRNA的转录的转录 。 反义寡聚核反义寡聚核苷酸（苷酸（类）类） 与mRNA特异性结合，阻断翻译过程 反义反义RNA的应用（一）的应用（一）利用反义利用反义RNA的原癌基因失活疗法：的原癌基因失活疗法：阻止或抑制原癌基因的过度表达及阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体抑制癌基因突变体mRNA成熟成熟 原癌基因原癌基因调控细胞生长，增殖与分化调控细胞生长，增殖与分化正常情况下，表达受严格控制正常情况下，表达受严格控制一旦调节失控，基因产物（生长
13、因一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信子，生长因子受体，胞内外传递信号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌增生，致癌 治疗方法治疗方法根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNA相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的化表达的mRNA的起始翻译位点结合成的起始翻译位点结合成RNA/RNA双链体双链体双链体阻止启动子与核糖体结合，或核双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿糖体沿mRNA上移，抑制翻译上移，抑制翻译 反义反义RNA的应用（二）的应用（二）抗抗HIV-l的作用的
14、作用 ：从翻译水平封闭从翻译水平封闭基因表达，并干扰基因表达，并干扰mRNA的剪切、的剪切、加工而实现抗病毒作用加工而实现抗病毒作用 tat为为HIV-l重要的调节基因，编码重要的调节基因，编码反式激活反式激活因子因子 Tat蛋白蛋白在逆转录病毒启动子在逆转录病毒启动子LTR之后连接之后连接反义反义tat与多聚与多聚TAR的构建物的构建物(LTR-25TAR-AS-TAT) ，具有反义具有反义tat及及TAR诱饵的双重作用诱饵的双重作用 由于由于LTR启动子受启动子受Tat蛋白的反式激蛋白的反式激活，使活，使tat在在HIV-l感染的细胞中感染的细胞中得以得以高表达高表达 将这种外源基因导入将
15、这种外源基因导入Molt-3 T细胞细胞系、系、CEM-SS T细胞系及健康人外周细胞系及健康人外周血单个核细胞血单个核细胞(PBMCs)，对实验及临对实验及临床分离病毒株均有抑制作用床分离病毒株均有抑制作用 gag是是HIV-1的结构基因，编码的结构基因，编码p24等病毒结构蛋白等病毒结构蛋白 Veres等构建了逆转录病毒载体，在等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于细胞内表达互补于gag区不同长度的反区不同长度的反义义RNA(225-1225nt) 在在CEM-SS T细胞及外周血细胞及外周血CD4细胞细胞均有抑制均有抑制HIV-l复制的作用复制的作用 长片段反义长片段反义RNA的抗的
16、抗HIV-l作用更好，作用更好，可能由于它能与不同种的可能由于它能与不同种的HIV-l RNA结结合而限制了病毒的逃逸合而限制了病毒的逃逸 新技术新技术 新思路新思路设计出具核酶活性的反义设计出具核酶活性的反义RNA，既既能与能与mRNA互补结合阻止互补结合阻止mRNA的的反义，又带有锤头状结构基因，能反义，又带有锤头状结构基因，能对靶序列（对靶序列（mRNA）特异性切割，特异性切割，可反复使用可反复使用反义寡聚脱氧核苷酸反义寡聚脱氧核苷酸Antisense oligodeoxyribonucleotidesASODN 一段与一段与mRNA或或DNA特异性结合并特异性结合并阻断其基因表达的人工
17、合成的阻断其基因表达的人工合成的DNA分子分子能通过封闭或抑制肿瘤细胞和病毒能通过封闭或抑制肿瘤细胞和病毒的关键编码基因来特异性抑制肿瘤的关键编码基因来特异性抑制肿瘤细胞增殖和病毒的复制细胞增殖和病毒的复制 作用机理作用机理1 . 在在DNA结合蛋白（如甲基化酶、结合蛋白（如甲基化酶、激活子、限制性内切酶等）的识别激活子、限制性内切酶等）的识别位点处，通过与靶基因结合形成三位点处，通过与靶基因结合形成三螺旋螺旋DNA，并且位点专一性地干扰并且位点专一性地干扰DNA和蛋白的结合、激活子的转录和蛋白的结合、激活子的转录起始或转录延伸等，进而阻止基因起始或转录延伸等，进而阻止基因转录和复制转录和复制
18、 作用机理作用机理2 . 对对ASODN进行化学改性（需要进行化学改性（需要铜离子和还原剂的存在），如在铜离子和还原剂的存在），如在ASODN的的3-末端连接上化学切割末端连接上化学切割试剂，可实现对靶基因的诱导切割试剂，可实现对靶基因的诱导切割等不可逆的反应，从而导致靶基因等不可逆的反应，从而导致靶基因的失活的失活 三螺旋三螺旋DNA 从转录水平进行抑制，尽可能完全从转录水平进行抑制，尽可能完全抑制特定基因的表达抑制特定基因的表达 以以DNA双螺旋分子的专一性序列为双螺旋分子的专一性序列为靶物，通过与该序列形成三螺旋靶物，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止基因转录来阻止基因转录 TFOTFO
19、-能与靶能与靶DNA高度序列特异性高度序列特异性结合形成三链结构的脱氧寡聚核苷酸结合形成三链结构的脱氧寡聚核苷酸靶序列靶序列-真核生物基因的启动子内含真核生物基因的启动子内含的同聚嘌呤的同聚嘌呤&同聚嘧啶序列同聚嘧啶序列 三螺旋三螺旋DNA三螺旋三螺旋DNA的组成结构单元是三碱基体，的组成结构单元是三碱基体，两种三碱基体的基本类型：两种三碱基体的基本类型：嘧啶嘧啶-嘌呤嘌呤-嘧啶型三碱基体，如嘧啶型三碱基体，如AT和和G+GC；嘌呤嘌呤-嘌呤嘌呤-嘧啶三碱基体，如嘧啶三碱基体，如GGC和和AAT 作用机制作用机制 合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶脱氧寡合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶脱氧寡核苷酸在一定条件下可
20、以与双螺旋核苷酸在一定条件下可以与双螺旋DNA分子的同聚嘌呤分子的同聚嘌呤&同聚嘧啶区同聚嘧啶区段结合形成局部的分子间三链段结合形成局部的分子间三链DNA ODN通常结合到双螺旋中同聚嘌呤通常结合到双螺旋中同聚嘌呤(A和和G)链上链上,其中每个碱基与双螺旋其中每个碱基与双螺旋靶区中的嘌呤碱基形成两个氢键靶区中的嘌呤碱基形成两个氢键 需考虑的问题：需考虑的问题：TFO可能与非专一性位点结合导致可能与非专一性位点结合导致正常的转录和翻译受干扰正常的转录和翻译受干扰富含富含G的的TFO 的三链结构会被某些的三链结构会被某些生理浓度的单价阳离子，尤其是生理浓度的单价阳离子，尤其是K+所抑制所抑制 总结
21、DNA mRNA 蛋白质蛋白质 转录转录 加工加工 翻译翻译反义反义DNA 反义反义RNA24.4反反义义核酸类药物的通用核酸类药物的通用生产方生产方法及技术法及技术化学合成法或酶法合成化学合成法或酶法合成只要人工设计合成只要人工设计合成12个碱基以上基因序个碱基以上基因序列的反义列的反义DNA或反义或反义RNA化学修饰以提高其稳定性化学修饰以提高其稳定性24.5 典例典例该反义核酸由三种反义寡核苷酸等质量构成，序列如下：该反义核酸由三种反义寡核苷酸等质量构成，序列如下：c-myc反义核苷反义核苷5-CAC CGA GGG GTC GAT GCA CT3.c-myb反义核苷反义核苷5-AGG
22、TAG CAG CTT CAG GGG AC3.bcr-abl反义核苷反义核苷5-CTG AAG GGC TTC TTC CTT AT3.应用美国应用美国Applied Biosystems公司出品的公司出品的ABI392全自全自动动DNA合成仪自动合成，合成条件严格按照该机的操作合成仪自动合成，合成条件严格按照该机的操作手册进行，所得粗产品，收集于手册进行，所得粗产品，收集于4ml的玻璃瓶中的玻璃瓶中。合成粗产品用真空离心方法（合成粗产品用真空离心方法（42）使氢氧化铵挥发）使氢氧化铵挥发，并用酒精萃取两次，干燥后溶于，并用酒精萃取两次，干燥后溶于10mmol/L Tris-HCl、0.4m
23、mol/L EDTA(pH7.6)的混合溶液中。的混合溶液中。使用使用FPLC离子交换色谱柱，型号为离子交换色谱柱，型号为MonoQHR5/5PH12.5(Pharmacia)，进行提纯，去除离，进行提纯，去除离子和盐。子和盐。提纯后的产品在冷冻干燥器内降温和去水，冷冻干燥得提纯后的产品在冷冻干燥器内降温和去水，冷冻干燥得到的反义核苷酸为白色粉末，于到的反义核苷酸为白色粉末，于0-20储存。储存。24.6反义类药物的发展前景与展望反义类药物的发展前景与展望反义核酸的摄入方式、细胞内分布特反义核酸的摄入方式、细胞内分布特点和作用机制仍然未完全清楚点和作用机制仍然未完全清楚反义核酸的稳定性、细胞摄
24、入率仍有反义核酸的稳定性、细胞摄入率仍有待提高待提高反义基因治疗技术在肿瘤治疗和病毒反义基因治疗技术在肿瘤治疗和病毒控制中显示出了诱人的应用前景，但控制中显示出了诱人的应用前景，但自身的稳定性、给药途径及与非靶自身的稳定性、给药途径及与非靶DNA或或mRNA杂交而出现对机体毒副杂交而出现对机体毒副作用等问题尚未最终解决，故其研究作用等问题尚未最终解决，故其研究尚处于试验阶段尚处于试验阶段 加强反义技术在肿瘤、抗病毒、抗心加强反义技术在肿瘤、抗病毒、抗心血管病方面的研究，以期获得防治人血管病方面的研究，以期获得防治人类重大疾病方面的实际应用。类重大疾病方面的实际应用。相信有朝一日，不仅反义核酸类药物相信有朝一日，不仅反义核酸类药物会普及使用，还会有更多的反义类药会普及使用，还会有更多的反义类药物（如反义蛋白类药物等）投放市场物（如反义蛋白类药物等）投放市场 结语结语 THANK YOU ！
