1、未培养微生物和极端微生物未培养微生物和极端微生物的研究进展的研究进展未培养微生物的研究和应用第一部分 经典分类方法： 以形态学及其生化特征分类，不足是不能提供进化和自然的关系； 经典分类的进展： 以16SrRNA序列相似性为代表，序列同源性97以上定义为一个种； 经典培养方法： 纯培养方法不足：约有50-100万种原核微生物，目前记载不足5000种经典微生物分类与培养黄石公园Obsidian Pool的故事 75 95 OC, 富含Fe(II)、H2S、H2、CO2Ward采用采用16SrRNA方法进行了研究，发现方法进行了研究，发现同源性只有同源性只有94.7%Nanoarchaeum eq
2、uitans来自冰岛海底热溢口的怪异新古菌 球菌：直径约为400 nm 基因组：500 kb 与一特异古菌宿主共生 极端嗜热（90） 特殊rRNA：古菌中新的一界N. equitansIgnicoccus99%的微生物尚属未知取样环境显微镜计数可培养率（%）土壤10111013个/千克0.010.1河、湖10111013个/升0.010.1地下水10111013个/升 界定生物圈范围 生物量最大 占总生物量的 60% 物种及代谢多样性最为丰富一个重要的认识一个重要的认识 自然界中已知微生物仅占总数的不到1%。“未知微生物或许是地球上最大的尚未开发的自然资源。”James Stanley未培养微
3、生物未培养微生物（uncultured microorganisms): 无法采用现有常规方法在实验室里培养的微生物。常规方法： 温度范围：10-70； 压力范围：常压条件； pH范围：2-10； 耐盐范围：低盐范围 共同协作的自然生存方式的崩溃共同协作的自然生存方式的崩溃 互养和共代谢，共栖、互生与共生；互养和共代谢，共栖、互生与共生； 急剧改变的生态位急剧改变的生态位 大多数微生物的复苏不仅需要营养物质，还需大多数微生物的复苏不仅需要营养物质，还需要提供其群落中的小生态环境，即生态位；要提供其群落中的小生态环境，即生态位；1、未培养微生物存在的生态原因、未培养微生物存在的生态原因生长环境的
4、极度营养变化生长环境的极度营养变化 对环境资源高亲和性的对环境资源高亲和性的K 型，适应低营养含量型，适应低营养含量和极低的生长率；和极低的生长率； 潜在外源活性物质的缺乏潜在外源活性物质的缺乏 纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活性物质；性物质；1、未培养微生物存在的生态原因、未培养微生物存在的生态原因2.1 2.1 宏基因组技术宏基因组技术 基本思路是直接提取环境微生物的总基因组基本思路是直接提取环境微生物的总基因组DNA, 用用核酸内切酶进行部分消化核酸内切酶进行部分消化, 再与载体连接再与载体连接, 转入宿主细胞转入宿主细胞, 构建基因文库，
5、通过筛选文库来寻找目的基因的阳性克构建基因文库，通过筛选文库来寻找目的基因的阳性克隆；隆； 优点优点： 不受已知基因的同源性序列的限制不受已知基因的同源性序列的限制, 因而所获得的基因而所获得的基因往往结构很新颖；因往往结构很新颖；2、未培养微生物的分子生物学研究方法、未培养微生物的分子生物学研究方法实实 例例 Rondon等以细菌人工染色体作为载体构建了两个土等以细菌人工染色体作为载体构建了两个土壤未培养微生物基因组文库，筛选到壤未培养微生物基因组文库，筛选到41个分别编码脂肪个分别编码脂肪酶、淀粉酶、核酸酶、抗菌、溶血作用等活性的基因，酶、淀粉酶、核酸酶、抗菌、溶血作用等活性的基因，DNA
6、序列与已知序列有很大的差异，其中一个编码的抗序列与已知序列有很大的差异，其中一个编码的抗菌肽结构属于新的基因家族菌肽结构属于新的基因家族；传统培养和宏基因组流程比较2.2 2.2 遗传指纹图谱技术遗传指纹图谱技术 核酸指纹图谱技术即核酸指纹图谱技术即DNA 指纹图谱法是指纹图谱法是1985年由年由Jeffreys 等等提出，它是通过用限制性内切酶消化和与特异的核心探针杂交提出，它是通过用限制性内切酶消化和与特异的核心探针杂交取得不同大小的取得不同大小的DNA片段的多点区带图谱，并与另一个片段的多点区带图谱，并与另一个DNA图图谱比较以评价其相似性的技术。谱比较以评价其相似性的技术。 优点优点：
7、 不受显隐性关系、环境和发育阶段的影响，允许同时进行多不受显隐性关系、环境和发育阶段的影响，允许同时进行多样本分析；样本分析； 缺点缺点： 过于依赖内切酶的选用过于依赖内切酶的选用，且，且方法繁杂方法繁杂、周期长周期长、实验条件高实验条件高等缺陷而无法大范围推广等缺陷而无法大范围推广； 方法方法： 梯度凝胶电泳技术，核酸杂交技术等梯度凝胶电泳技术，核酸杂交技术等3.1 3.1 用低浓度的培养基来进行分离培养用低浓度的培养基来进行分离培养 一般认为一般认为, 传统的培养基营养太丰富传统的培养基营养太丰富, 不适合于那些原先生不适合于那些原先生长在缺乏营养的环境中的微生物长在缺乏营养的环境中的微生
8、物, 如海洋微生物；如海洋微生物；实例实例1： Connon等用比实验室中常用的培养基营养低等用比实验室中常用的培养基营养低3个数量级个数量级, 小小体积、低营养的培养基来分离海洋中的微生物。从体积、低营养的培养基来分离海洋中的微生物。从11个样品个样品中分离出中分离出20500个培养物，其中有个培养物，其中有4个单细胞系是以前从未培个单细胞系是以前从未培养过、也从未描述过的。通过这种方法，使海洋样品中浮游养过、也从未描述过的。通过这种方法，使海洋样品中浮游细菌的可培养率提高到细菌的可培养率提高到14%，比以前提高了，比以前提高了141400倍。倍。 3、未培养微生物的可培养方法、未培养微生物
9、的可培养方法 让培养条件尽量模拟成原先的自然状态，如用土壤浸让培养条件尽量模拟成原先的自然状态，如用土壤浸提物和海水滤过液来制作培养基提物和海水滤过液来制作培养基, 该方法已趋成熟该方法已趋成熟；实例2： Zengler K等设计了一个非常精妙的方法等设计了一个非常精妙的方法，将细胞包埋在将细胞包埋在凝胶微滴板中凝胶微滴板中， 在低营养的流动培养液中进行培养在低营养的流动培养液中进行培养，再用再用流动血细胞计数法检测微滴板上有多少个微克隆流动血细胞计数法检测微滴板上有多少个微克隆。这是一个这是一个开放流动的系统开放流动的系统， 微生物间的代谢产物及信号分子可在凝微生物间的代谢产物及信号分子可在
10、凝胶空隙中进行扩散而被其他菌利用。这与自然环境有很多的胶空隙中进行扩散而被其他菌利用。这与自然环境有很多的相似之处相似之处， 因而新培养出来的微生物种类也大大增加。因而新培养出来的微生物种类也大大增加。 这种方法可用于包括土壤和海水的各种环境这种方法可用于包括土壤和海水的各种环境； 3.2 根据微生物特性根据微生物特性 特异添加营养成分变成可培养特异添加营养成分变成可培养实例实例1： Kashefi 等根据嗜高热微生物利用等根据嗜高热微生物利用Fe ( III) 作为终端电子受作为终端电子受体这一高度保守的特性体这一高度保守的特性，在培养基中添加非常微量的在培养基中添加非常微量的Fe ( II
11、I) 氧化物氧化物。该该方法的前提是对微生物特性有一定的了解方法的前提是对微生物特性有一定的了解。实例实例2： Santini 等从澳大利亚金矿中分出以亚砷酸为电子供体，氧等从澳大利亚金矿中分出以亚砷酸为电子供体，氧为受体，以为受体，以CO2 为唯一碳源的化能自养菌（为唯一碳源的化能自养菌（NT-26）。）。16SrDNA 序列分析表明，序列分析表明，NT-26 属于属于 -Proteobacteria 土壤土壤杆菌的一个根瘤菌分支，可能是一新种。杆菌的一个根瘤菌分支，可能是一新种。 环境样品混合基因组DNADNA文库目标基因/基因簇细胞破碎、DNA提取克隆活性筛选同源筛选未培养微生物基因资源
12、的开发基于培养非依赖（culture-independent）技术的尝试克隆酶生物活性物质PCR1.环境样品DNA的提取和纯化 细胞收集法 Agarose plug 直接裂解法 物理法：研磨、超声波、冻融、bead beating 化学法：溶菌酶、Proteinase K、SDS、酚等DNA提取DNA纯化 CTAB、PVPP CsCl密度梯度离心、电洗脱、柱层析等2.文库筛选 测序/基因注释 活性筛选 常规活性检测 基于BAC的功能基因组学平台 同源筛选 PCR方法、分子杂交 微排列技术、DNA芯片DNA产量和回收率产量和回收率环境样品粗制 DNA 产量（g/g）纯化 DNA 产量（g/g）纯
13、化回收率(%)样品 A25.615.561样品 B21.34.722样品 C3.21.959样品 A：微生物所附近的土壤样品样品 B：北京造纸七厂排污出口处的土壤样品样品 C：云南腾冲温泉样品国内研究实例国内研究实例1王啸波等，微生物学报，王啸波等，微生物学报，20012001，4141（2 2）：）：133-140133-140Restriction digestion of three purified environmental DNA samples分离自环境样品的纯化DNA的酶切试验Size distribution of inserts in randomly selected c
14、lones腾冲热泉试验文库：库容约1 Mb；插入片段为3-8 kb环境样品DNA文库构建环境样品DNA文库的初步评估测序样品编号 推测可能功能 COG COG 功能分类 S 值 E 值9912 Periplasmic protease COG0793 M 41 0.0019914 Ribonuclease HII COG0164 L 29 5.19915 Branched-chain amino acid COG0559 E 27 9.6 ABC-type transport system9916 Molecular chaperones, DnaJ family COG0484 O 42 6
15、e-049918 Protein-disulfide isomerases DsbC/DsbG COG1651 O 64 8e-119919 Periplasmic protease COG0793 M 39 0.003e10 Dipeptidyl aminopeptidases COG1506 E 31 0.99 /acylaminoacyl-peptidasese3 Uncharacterized ACR COG1469 S 31 1.3e5 Uncharacterized proteins, BmrU family COG1597 S 31 1.00e6 Thioredoxin redu
16、ctase/ COG0492 O 48 7e-06 alkyl hydroperoxide reductasee8 Anaerobic dehydrogenases, COG0243 C 365 e-101 typically selenocysteine-containinge9 Ribosomal protein S1 COG0539 J 66 2e-11p10 Periplasmic protease COG0793 M 29 3.8p7 Anaerobic dehydrogenases, COG0243 C 352 e-110 typically selenocysteine-cont
17、aining_Gene annotation of partial DNA sequences derived from inserts in randomly selected clonesSequence comparison between the deduced amino acid sequenceof an ORF and 12 NADPH-binding thioredoxin reductases FAD CONSENSUS T.G.AAGD MP592 PQGFLITNEQ-METSLKGLFAAGDCRSKHFRQIGTA (266-300) MG102 QNGFILGDE
18、N-MQTNIKGFYVAGDCRSKSFRQIATA (266-300) TrxB N-GYIKVQSGIHGNATQTSIPGVFAAGDVMDHIYRQAITS (261-299) YDR353w EAGYIKTVPG-SSLTSVPGFFAAGDVQDSKYRQAITS (265-300) BS_ahpF RMGEIIVDKH-GATSVPGLFAAGDCTDSAYNQIIIS (457-491) HI1158 N-GYIVVKSGLDGNATATSVEGVFAAGDVMDHNYRQAITS (260-298) jhp0764 EYGSIVVDFS-MKTNVQGLFAAGDIRIFA
19、PKQVVCA (259-293) HP0825 EYGSIVVDFS-MKTNVQGLFAAGDIRIFAPKQVVCA (259-293) MJ1536 KKGFIKTDEN-CRTNIDGIYAVGDVRG-GVMQVAKA (250-283) MTH708 KGGYIITDKF-QRTNVPLVYAAGDITG-GLNQWVTA (252-285) PH1426 EYGYIPVDMY-MRTKVPGIFAAGDITN-VFKQIAVA (279-312) TM0869 PYGYVITDEN-METSVKGIYAVGDVRKKNLRQIVTA (267-301) e6 GLGNLIVDS
20、Q-QRTAISGLYAIGDIVN-EINQLAVA (125-158)MP592，Mycoplasma pneumoniae；MG102，Mycoplasma genitalium；trxB，Escherichia coli；YDR353w，Saccharomyces cerevisiae； BS_ahpF，Bacillus subtilis； HI1158，Haemophilus influenzae；jhp0764，Helicobacter pylori J99； HP0825，Helicobacter pylori；MJ1536，Methanococcus jannaschii；MT
21、 H708，Methanobacterium thermoautotrophicum； PH1426， Pyrococcus horikoshii； TM0869， Thermotoga maritima20个随机克隆插入片段 12个可预测功能开放阅读框 序列均未见报道研究结果简要分析研究结果简要分析 20个测序样品中，14个为新序列； 14个序列中12个含可预测功能的基因； 样品e6含编码硫氧蛋白还原酶基因一部分； 样品9918含蛋白二硫键异构酶基因一部分；为相关酶的性能改造提供基础Davies的工作(1997)土壤样品混合基因组DNAPolyketide synthase基因PCR国外研究
22、实例1J. Davies (1997) 从土壤中直接获得全长KSb基因的策略J. Davies (1997)KSa和KSb基因产物的系统发育学关系Handelsman和Goodman的工作(1998)土壤样品混合基因组DNA元基因组文库（BAC文库）酶、小分子活性物质元基因组（metagenome): 环境中所有微生物基因组的总和。国外研究实例2 Handelsman & Goodman (1998) 两个土壤元基因组文库（库容：1 Gbp） Handelsman & Goodman (1998) Handelsman & Goodman (1998)未培养微生物系统发育学分析与生物学分析的偶
23、联基因簇的克隆 Handelsman & Goodman (1998) Osburne et al. (2000) 抗细菌活性的筛选Diversa公司 (1995-)未培养微生物基因资源大规模开发的先驱采集全球各种生态环境样品高效筛选新基因、基因簇针对不同应用需要优化基因及基因簇获得高效、高稳定性酶和小分子生物活性物质5,000 genomes109 clones108109 clone.assays/dayDiversa产品 “酶订购计划” 数百种新酶 ThermalAce DNA polymerase (由Invitrogen销售） Replicase微生物世界的淘金者 Diversa A
24、RIAD Pharmaceuticals, Inc. TerraGen Discovery, Inc. Khosan Biosciences, Inc. Maxygen, Inc.新世纪的挑战新世纪的挑战 任务：了解自然界中微生物的种类、相互作任务：了解自然界中微生物的种类、相互作用、对环境的影响；开发微生物资源用、对环境的影响；开发微生物资源 解决方案解决方案 代表性生态环境的系统生态学研究代表性生态环境的系统生态学研究 发展新的富集培养和分离策略，结合采用分子发展新的富集培养和分离策略，结合采用分子生物学和培养依赖方法，研究未培养微生物生物学和培养依赖方法，研究未培养微生物 微生物系统科学
25、：微生物系统科学：技术集成、学科集成技术集成、学科集成极端微生物及其生物技术价值极端微生物及其生物技术价值第二部分第二部分一、极端微生物的概念 研究的需求：研究的需求： 许多工业过程需要高压、高温、低温、高盐许多工业过程需要高压、高温、低温、高盐碱或耐辐射条件，一般生物催化剂难以胜任苛碱或耐辐射条件，一般生物催化剂难以胜任苛刻条件下的工作刻条件下的工作； 定义：定义： 是依赖于一种或多种极端物化因子的极端生是依赖于一种或多种极端物化因子的极端生命形式，在命形式，在100100以上或以上或00以下、近饱和的盐以下、近饱和的盐度、度、pH10pH10或或pH2pH2、高压和放射条件等极端环、高压和
26、放射条件等极端环境下的极端生命形式境下的极端生命形式. .二、极端微生物的类型 嗜热菌嗜热菌(thermophiles)(thermophiles) 嗜冷菌嗜冷菌(psychrophiles)(psychrophiles) 嗜碱菌嗜碱菌(alkaliphiles)(alkaliphiles) 嗜酸菌嗜酸菌(acidophiles)(acidophiles) 嗜盐菌嗜盐菌(halophiles)(halophiles) 嗜压菌嗜压菌(barophiles)(barophiles)三、极端微生物的应用潜力 PCRPCR技术中的高温技术中的高温Tag DNATag DNA聚合酶；聚合酶； 洗涤剂洗涤
27、剂中的高温蛋白酶和脂肪酶、碱性蛋白和脂肪酶；中的高温蛋白酶和脂肪酶、碱性蛋白和脂肪酶； 极端嗜盐菌生产极端嗜盐菌生产PHBPHB、核苷酸，将大大简化后处理工、核苷酸，将大大简化后处理工艺，降低生产成本；艺，降低生产成本； 油田油田的油层多为极端环境（高温、高压、高盐、厌的油层多为极端环境（高温、高压、高盐、厌氧），一般微生物难以发挥作用，极端微生物将会带氧），一般微生物难以发挥作用，极端微生物将会带来采油技术的一场革命来采油技术的一场革命极端微生物的应用潜力 在含硫的在含硫的低品位矿床低品位矿床中，硫杆菌可产生大量硫酸，中，硫杆菌可产生大量硫酸，使使pHpH降得很低，溶出很多贵重金属。对极端嗜
28、酸降得很低，溶出很多贵重金属。对极端嗜酸菌特别是嗜酸嗜热菌的深入研究，已实现了湿法菌特别是嗜酸嗜热菌的深入研究，已实现了湿法冶金；冶金； 污染环境中，盐碱度高、毒物浓度高、环境温度污染环境中，盐碱度高、毒物浓度高、环境温度低，普通的生物技术治理难有作为，而极端微生低，普通的生物技术治理难有作为，而极端微生物可在物可在高盐碱高盐碱、低温条件下行使最佳功能，在环、低温条件下行使最佳功能，在环境整治中将大有作为。境整治中将大有作为。极端微生物的应用潜力 极端微生物具有多样的代谢类型，通过对代谢途极端微生物具有多样的代谢类型，通过对代谢途径的认识与改造，极端微生物可过量积累有机酸、径的认识与改造，极端
29、微生物可过量积累有机酸、氨基酸等，实现超级生产；氨基酸等，实现超级生产； 嗜热微生物可实现嗜热微生物可实现酒精酒精的真正高温发酵，实现酒的真正高温发酵，实现酒精在发酵过程中的分离蒸馏，引发酒精生产工艺精在发酵过程中的分离蒸馏，引发酒精生产工艺的划时代变革；的划时代变革；极端微生物的应用潜力 农产品加工中，一般生物过程无法实现对纤维素、农产品加工中，一般生物过程无法实现对纤维素、半纤维素的有效转化。在极端条件下行使功能的极半纤维素的有效转化。在极端条件下行使功能的极端微生物及其极端酶可在高温、酸、碱等条件下对端微生物及其极端酶可在高温、酸、碱等条件下对秸杆、废渣等进行处理，为解决资源的有效转化利
30、秸杆、废渣等进行处理，为解决资源的有效转化利用提供新途径。用提供新途径。 极端微生物已经适应了各种各样的极端环境，因而极端微生物已经适应了各种各样的极端环境，因而提供了一个特有的遗传信息来源，从中发掘新型产提供了一个特有的遗传信息来源，从中发掘新型产物极具潜力物极具潜力. .四、极端微生物的国内外研究进展 美国美国近年来非常注重极端微生物的研究，不仅在基近年来非常注重极端微生物的研究，不仅在基础研究方面开展了系统的工作，在极端微生物的生础研究方面开展了系统的工作，在极端微生物的生物技术利用方面已经开始实用化，高温物技术利用方面已经开始实用化，高温DNADNA聚合酶、聚合酶、碱性酶及极端采油菌已
31、在产业上产生了重要影响，碱性酶及极端采油菌已在产业上产生了重要影响，为推动整个生物技术领域的发展、协调环境与可持为推动整个生物技术领域的发展、协调环境与可持续发展等方面作出了重要贡献。在基因芯片、新材续发展等方面作出了重要贡献。在基因芯片、新材料、新药等方面，对极端微生物的作用也有很高的料、新药等方面，对极端微生物的作用也有很高的期望。期望。极端微生物的国内外研究进展 欧洲欧洲是开展极端微生物研究较早的地区，他们主是开展极端微生物研究较早的地区，他们主要研究极端微生物生命机理的分子基础及新酶、要研究极端微生物生命机理的分子基础及新酶、新产物的开发。欧盟于新产物的开发。欧盟于9797年启动一个耗
32、资年启动一个耗资12001200万万美元的计划美元的计划“极端细胞工厂极端细胞工厂”，探索极端微生，探索极端微生物在不同工业中的可能用途，已于物在不同工业中的可能用途，已于9999年年1111月结束。月结束。作为欧盟的整体策略，极端微生物项目的目的是作为欧盟的整体策略，极端微生物项目的目的是“利用生物技术改造现在的化学工业过程利用生物技术改造现在的化学工业过程”，项，项目协调人目协调人AntrinikanAntrinikan教授认为，极端微生物工业教授认为，极端微生物工业的时代已经到来。的时代已经到来。极端微生物的国内外研究进展 日本日本对极端微生物研究起始于对极端微生物研究起始于196819
33、68年，年，K. K. HorikoshiHorikoshi教授有极端微生物研究之父之称，教授有极端微生物研究之父之称，正是他的工作使人们认识到了极端微生物的价正是他的工作使人们认识到了极端微生物的价值。值。他们开发了大量的嗜碱菌及其碱性酶，获他们开发了大量的嗜碱菌及其碱性酶，获得了得了2020多种碱性酶的专利，碱性纤维素酶、环多种碱性酶的专利，碱性纤维素酶、环糊精酶、蛋白酶等都在工业中得到了实际应用。糊精酶、蛋白酶等都在工业中得到了实际应用。 19911991年日本开始实施了著名的深海之星年日本开始实施了著名的深海之星（Deep-starDeep-star）计划，）计划，耗资耗资5050亿日
34、元进行为期亿日元进行为期5 5年深海极端微生物的研究，现在每年仍维持年深海极端微生物的研究，现在每年仍维持300300万美元的资助，从深海中获得了万美元的资助，从深海中获得了10001000多株多株嗜压、嗜冷、嗜热、嗜碱及耐有机溶剂的多类嗜压、嗜冷、嗜热、嗜碱及耐有机溶剂的多类型的极端微生物，最引人注目的则是耐有机溶型的极端微生物，最引人注目的则是耐有机溶剂菌，可耐受的溶剂浓度可达剂菌，可耐受的溶剂浓度可达5050。极端微生物的国内外研究进展极端微生物菌株发现极端微生物菌株发现 获得了产生耐热、盐、碱、酸的酯酶、获得了产生耐热、盐、碱、酸的酯酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉蛋白酶、纤维素
35、酶、半纤维素酶、淀粉酶、过氧化氢酶等酶的酶、过氧化氢酶等酶的极端微生物237株，完成了其中，完成了其中183株菌的系统发育学分析，获得新的分类单位。 发现了一些极端微生物类群与产酶关系发现了一些极端微生物类群与产酶关系, ,如如首次证明了证明了Halomonas和和Bacillus rRNA 第第7类群是碱湖中主要的多糖水类群是碱湖中主要的多糖水解酶产生者解酶产生者. .我国的研究进展实例我国的研究进展实例盐湖分离的部分嗜盐古菌产酶分析盐湖分离的部分嗜盐古菌产酶分析淀粉酶：淀粉酶：35 35 株株, , 酯酶：酯酶：6565株株, , 蛋白酶：蛋白酶：2424株株产水解酶嗜碱菌的系统发育分析产
36、水解酶嗜碱菌的系统发育分析 0.05 T10 Deleya cupida DSM 4740T (L42615) F23 Halomonas desiderata PB2T (X92417) Bacillus clarkii DSM 8720T (X76444) Halomonas campisalis ATCC 700597T (AF054286) Bacillus agaradhaerens DSM 8721T (X76445) N16-5 SL-CS2_ DC-AW1 (ZB-AS16, DC-CS1) Salinicoccus roseus DSM 5351T (X94559) DC-C
37、S8 Lactobacillus malefermentans DSM 20570T (AJ417736) Rheinheimera baltica OSBAC1T (AJ441080) Bacillus cohnii DSM 6307T (X76437) Oceanobacillus oncorhynchii R-2 (AB188089) Flavimonas oryzihabitans IAM1568 (D84004) Thermonema rossianum NR-27T (Y08956) Amphibacillus tropicus Z-7792 (AF418602) F10 T2 A
38、mphibacillus xylanus JCM 7361T (D82065) Oceanobacillus iheyensis HTE831 (AB010863) Z7 Bacillus pumilus NCDO 1766 (X60637) Z6 Bacillus halmapalus DSM 8723T (X76447) F6 F26 F24 ZB-CS2 Salinicoccus hispanicus DSM 5352T (AY028927) ZB-CS5 (ZB-CS4) BG-CS10 (DC-AW6) Exiguobacterium aurantiacum NCDO 2321 (X
39、70316) Z8 Cyclobacterium marinum ATCC 43824T (M62788) Z3 N10 1E1 Pseudomonas sp. MBIC3963 (AB021318) F5 Halomonas elongata ATCC 33173T (X67023) Halomonas salina ATCC 49509T (X87217) BG-CS1 DC-CW5 100 100 100 82 100 100 82 96 93 100 100 99 90 100 100 89 99 100 100 99 100 100 100 100 100 100 86 100 10
40、0 100 99 99 100 n 建立环境基因文库建立环境基因文库168Mn 环境基因文库构建技术和高通量筛选技术环境基因文库构建技术和高通量筛选技术n 分离新酶基因分离新酶基因6个个环境基因文库构建与酶基因筛选环境基因文库构建与酶基因筛选环境基因文库环境基因文库LibrarySourceVectorE. Coli Host strainNo. clonesInsert sizeTC1, TC3 TC5 TC7 & TC9Chinese geothermalpCRT7/CT-TOPOTop 10 F60,0000.5 kbTC1, TC3 TC5 TC7 & TC9Chinese geoth
41、ermalpCRT7/CT-TOPOBL 21(DE3)pLySs60,0000.5 kbLP3, TC1, TC5, TC7, TC9Chinese geothermalpCRT7/CT-TOPOTop 10 F4003 kbEN2Chinese halophile pCRT7/CT-TOPOTop 10 F70002 kb 热泉样品热泉样品DNADNA文库文库120Mb120Mb 载体为载体为pCRT7/CT-TOPOpCRT7/CT-TOPO LibraryE. coli Hostcloning vector No. of clones1HT-EcoRITOP10pUC19-EcoRI1
42、.0002HT-HindIIITOP10pUC19-HindIII2.0003TC11TOP10pUC19-HindIII5.0004TC12 isolateDH5apUC1840.000 盐碱湖样品盐碱湖样品DNADNA文库文库48Mb48Mb 载体为载体为pUC19pUC19，插入片段插入片段2-6kb2-6kb1.1 kb2.8 kb11.5 kb5.0 kb1，高温高温alpha-glucosidase gene： 2.2kb, 与其它酶的相似性小于与其它酶的相似性小于51，2，碱性，碱性-mannanase gene， 1479bp, 与其它酶的相似性小于与其它酶的相似性小于59 3
43、， 碱性碱性- amylase gene： 1761bp, 与其它酶基因相似性小于与其它酶基因相似性小于30 4，高温，高温6-phosphate-beta-glucosidase 2.4kb, 与其它酶的相似性小于与其它酶的相似性小于51 5，酸热，酸热-mannanase gene ， 27% partly to endo-1,4-beta-mannocidase6，碱热酯酶基因，碱热酯酶基因新基因新基因获得6个新基因极端酶纯化表征与结构功能极端酶纯化表征与结构功能 碱性过氧化氢酶碱性过氧化氢酶 分子量分子量140kd 140kd 温度温度20-4020-40,pH11,pH11 碱性淀粉
44、酶碱性淀粉酶 分子量分子量 60kD 60kD 温度温度5050 ，pH10pH10 碱性甘露聚糖酶碱性甘露聚糖酶 分子量分子量 50kD 50kD 温度温度7070 ，pH9.5pH9.5 酸性甘露聚糖酶酸性甘露聚糖酶 分子量分子量 38kD 38kD 温度温度6565 ，pH5.5 pH5.5 高温葡萄糖苷酶高温葡萄糖苷酶 分子量分子量 92kD 92kD 温度温度6565 ，pH5.7pH5.7 分子量分子量102kD 102kD 温度温度9090 ，pH6pH6020406080100120345678910 11 12 13pHRelative activity (%)0204060
45、80100120020406080T ()Relative activity (%)结构与功能研究结构与功能研究位点突变与酶特性的关系位点突变与酶特性的关系mutant pH profiles0204060801001208.599.51010.511pHrelative activity(100%)A-LA-PA-Gwide type野生型甘露聚糖酶及其突变型特性比较野生型甘露聚糖酶及其突变型特性比较 野生型甘露聚糖酶及其突变型预测的三维结构的比较野生型甘露聚糖酶及其突变型预测的三维结构的比较已获得结晶，为揭示酶结构与功能、酶多样性的已获得结晶，为揭示酶结构与功能、酶多样性的结构机制奠定了基
46、础。结构机制奠定了基础。收集不同种收集不同种属的海绵属的海绵5 5种种 从繁茂膜海绵分离的放线菌，大部分属于链霉菌属从繁茂膜海绵分离的放线菌，大部分属于链霉菌属StreptomycesStreptomyces，一些分属，一些分属6 6个稀有放线菌属。其中一株与个稀有放线菌属。其中一株与Actinoalloteichus Actinoalloteichus cyanogriseuscyanogriseus，相似度为，相似度为96.7%96.7%，可能是一新种，可能是一新种。放线菌放线菌300300株株细菌细菌100100株株真菌真菌100100株株甲壳素降解酶甲壳素降解酶过氧化物酶过氧化物酶海洋
47、微生物多样性海洋微生物多样性Effect of organic solvents （50）on the activity of YP1A protease(lgP5.6)Dodecyl alcohol(lgP2.9)Octanol(lgP4.0)Heptane(lgP5.6)Decane(lgP3.2)Cyclohexane(lgP2.5)Toluene(lgP2.0)Benzene(lgP0.8)Butanol(lgP-0.23)Acetone(lgP0.05)Isopropanol(lgP-1.35)DMSO(lgP-1.0)DMF020406080100120140solventsRel
48、ative activity of protease(%) YP1A Trypsin50%(V/V)organic solvent, 40 C, 200 rpm for 2 h. The tube with the addition of buffer instead of solvents was used as control. Effect of organic solvents on substrate specificity of YP1A proteaseDMFDMSO异丙醇异丙醇L-Glutamic acid-（4-nitroanilide）N95.3NL-Alanine-4-n
49、itroanilide hydtochloride4.22.70.0L-Leucine-nitroanilide20.612.533.7L-Lysine-nitroanilide dihydrobromide1.20.033.7Z-L-Phe-nitroanilide0.00.0100NundissolvedThe YP1A protease showed different substrate specificity responding with the different solventsEffect of organic solvents on the activity of LP8
50、lipase DMSO(-1.35)DMF(-1)Methanol(-0.76)Acetonitrile(-0.34)Ethanol (-0.24)Acetone(-0.23)Isopropanol(0.28)n-Butanol(0.8)Benzene(2) Toluene(2.5)n-Octanol(2.9)Cyclohexane(3.2)n-heptane(4)n - decane(5.6)tetradecane(7.6)0.00.51.01.52.02.5Relative activityOrganic solvents A novel lipase with high activity
