1、现代实验动物学技术现代实验动物学技术一、转基因动物一、转基因动物转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果。中的突出成果。近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。等多方面做出了很大的贡献。 （一）转基因动物的概念（一）转基因动物的概念 转基因动物（转基因动物（transgenic animal）是指以实验方法导入的）是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类外源基因在其
2、染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。动物。外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代，这种外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代，这种动物叫转基因动物。动物叫转基因动物。严格说，转基因动物有别于嵌合体。严格说，转基因动物有别于嵌合体。嵌合体动物（嵌合体动物（chimeric animal）：只有部分组织细胞的基因组）：只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因。中整合有外源基因。 逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体。雄原核显微注射法制备的动物第备的动物第一代均为嵌合体。雄原核显微注射法制备的动物第一代中一代
3、中1-10%为嵌合体（延迟整合）。为嵌合体（延迟整合）。 Gordon等人首次成功地将含有等人首次成功地将含有HSV和和SV40DNA片段片段的重组质粒的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源核内，得到了带有这种外源DNA顺序顺序TGM。 1982年年Palmiter等运用此法得到的所谓等运用此法得到的所谓“超级巨鼠超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。曾引起整个生物学界的轰动。 到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。牛等等大小动物。 从转基因动物所获得的资
4、料几乎涉及医学遗传、肿瘤从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。基因治疗的开发研究等。（二）转基因动物的制作方法（二）转基因动物的制作方法1、受精卵雄原核显微注射法、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（、胚胎干细胞（ES细胞）法细胞）法3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法4、体细胞核移植法、体细胞核移植法5、精子载体法、精子载体法6、YAC法法1、雄原核显微注射法、雄原核显微注射法 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的
5、载体将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。续发育获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。目前应用较广泛，最早最经典的方法。这一方法的实验程序如下：这一方法的实验程序如下：（1）准备假孕母鼠（养母）准备假孕母鼠（养母）（2）受精卵的准备）受精卵的准备（3）基因导入）基因导入（4）胚胎移植）胚胎移植（5）对幼鼠的鉴定）对幼鼠的鉴定Timing of Pre-Implantation eventsExpression of Exogenous Gen
6、esScreening Strategies Southerns, Induction/Loss of Restriction sites, PCR RT-PCR 测定表达产物活性：测定表达产物活性：ELISA，RIA 其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时间。间。 基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中。基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中。外源基因的插入会引起宿主基因的外源基因的插入会引起宿主基因的DNA序列重排，序列重排，缺失，重复或易位。缺失，重复或易位。 外源基因也可不插入呈游离状态，以质粒形式存在外源基因也可不插入呈游
7、离状态，以质粒形式存在表达功能并传给子代，其详细机理现在也不是很清表达功能并传给子代，其详细机理现在也不是很清楚。楚。优点：优点： 外源外源DNA大小基本不受限制（大小基本不受限制（1-50kb）；导入过）；导入过程直观；程直观； 整合率高整合率高缺点：缺点： 设备昂贵、环节较多设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜）低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性基因整合随机性 转基因沉默转基因沉默2、胚胎干细胞（、胚胎干细胞（ES细胞）法细胞）法 ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立
8、起来的多潜细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。能细胞系。 将携带有外源基因的将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。生嵌合体及转基因动物。 它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。下表现出不同的功能状态。在在ES细胞上的基因操作：细胞上的基因操作： 可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙可以通过逆转录病
9、毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。细胞。因此，借用因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。某种基因功能的动物后代。Generating ES CellsScreening ES Cell ClonesScreening Plate - Grow for DNA, restriction digest, then SouthernMaster Plat
10、e - Freeze cells or continue to grow and subplatePick clones and trypsinizeplate and growRetrieval of BlastocystsInjection of ES cells into blastocysts优点：优点：外源基因整合情况的可控性高。外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。达的水平及插入的稳定性。外源基因导入外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选
11、方便。便。缺点：缺点：ES细胞系建立及培养困难细胞系建立及培养困难维持维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体所得个体为嵌合体目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。动物上应用较晚。（三）转基因动物的特性（三）转基因动物的特性 整合拷贝数整合拷贝数1-100左右，多拷贝常以首尾相连接的左右，多拷贝常以首尾相连接的形式存在。形式存在。 整合是随机的。整合是随机的。 整合是稳定的，可以传给子代。整合是稳定的，可以传给子代。 外源基因可以在一种组织或多种组织中表达。外源基因可以在一种组
12、织或多种组织中表达。 少数外源基因两侧序列有重排现象。少数外源基因两侧序列有重排现象。 基因表达强弱与拷贝数无关，与基因表达强弱与拷贝数无关，与“位置效应位置效应”有有关。关。（四）转基因动物的意义（四）转基因动物的意义 转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发展起转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发展起来的。来的。而许多基因的表达是无法通过转染的方法来研而许多基因的表达是无法通过转染的方法来研究：究： 基因表达有时空与组织的特异性；基因表达有时空与组织的特异性； 外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；因此，只有通过转基因的动物才有
13、可能研究基因的表因此，只有通过转基因的动物才有可能研究基因的表达、调控及基因之间的相互作用。达、调控及基因之间的相互作用。 进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体水平的表现调控规律。水平的表现调控规律。 转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究。研究。 也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要。也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要。 还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。质。二、免疫缺陷动物二、免疫缺陷动物 （Immunod
14、eficient animal）（一）定义：（一）定义： 是指由于先天性遗传突变或用人工方法。造是指由于先天性遗传突变或用人工方法。造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。（二）分类：（二）分类：1、先天性免疫缺陷动物：、先天性免疫缺陷动物： a. T淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠，裸大鼠淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠，裸大鼠 b. B淋巴细胞功能缺陷动物：淋巴细胞功能缺陷动物：CBA/N小鼠小鼠 c. NK细胞功能缺陷动物：细胞功能缺陷动物：Beige小鼠小鼠 d. 联合免疫缺陷动物：联合免疫缺陷动物：SCID小鼠等小鼠等2、获得性免疫缺陷动物：猴、小鼠
15、、猫等、获得性免疫缺陷动物：猴、小鼠、猫等AIDS模模型型（三）裸小鼠（三）裸小鼠（Nude Mice）1、发现与发展、发现与发展 1962年英国格拉斯哥医院年英国格拉斯哥医院Grist在非近交系的小鼠中在非近交系的小鼠中偶然发现有个别小鼠无毛。偶然发现有个别小鼠无毛。 1966年证实是由于第年证实是由于第11对染色体基因突变所致。对染色体基因突变所致。 1968年，年，Pantelouris解剖发现裸鼠失去了正常的胸腺。解剖发现裸鼠失去了正常的胸腺。 由于裸鼠原种抵抗力差，生育力低，寿命短，不能由于裸鼠原种抵抗力差，生育力低，寿命短，不能用于实际。和纯系用于实际。和纯系BALB/C，C3H，
16、C57BL/6小鼠交小鼠交配，不断选育，获得了三种近交系鼠（配，不断选育，获得了三种近交系鼠（Inbred Nude Mice）新种。）新种。 1969年年Rygaard首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成功。功。 裸鼠自发现以来，广泛应用于肿瘤学、免疫学和病毒裸鼠自发现以来，广泛应用于肿瘤学、免疫学和病毒学等多个学科的研究。学等多个学科的研究。2、生物学特点、生物学特点（1）一般特点）一般特点 纯合子突变裸鼠（纯合子突变裸鼠（nu/nu）主要表现为无毛以及胸腺）主要表现为无毛以及胸腺缺陷。杂合子小鼠缺陷。杂合子小鼠（nu/+）各方面表现正常。）各方面表现正常。 体
17、重小于同龄普通鼠，发育缓慢。体重小于同龄普通鼠，发育缓慢。 必须养育在必须养育在SPF环境中环境中 。 繁殖方式：一般采用隐性纯合子雄性与杂合子雌鼠繁殖方式：一般采用隐性纯合子雄性与杂合子雌鼠交配（交配（nu/nunu/+）。）。（2）解剖生理特点）解剖生理特点 胸腺残留一些上皮样细胞；淋巴组织胸腺依赖区的淋胸腺残留一些上皮样细胞；淋巴组织胸腺依赖区的淋巴细胞消失；外周血淋巴细胞减少。巴细胞消失；外周血淋巴细胞减少。 虽然有原始的虽然有原始的T细胞，但缺乏成熟的细胞，但缺乏成熟的T细胞。细胞。T细胞的细胞的辅助，抑制及杀伤功能不全。在混合淋巴细胞反应中辅助，抑制及杀伤功能不全。在混合淋巴细胞反
18、应中无有丝分裂反应，对刀豆素无有丝分裂反应，对刀豆素A或植物凝集素或植物凝集素P无促分裂无促分裂原应答。原应答。 无接触敏感性，无移植排斥，无移植物无接触敏感性，无移植排斥，无移植物 抗宿主反应。抗宿主反应。 B细胞数量正常但功能有缺陷，合成的免疫球蛋白主要细胞数量正常但功能有缺陷，合成的免疫球蛋白主要是是IgM，只有少量，只有少量IgG。 粒细胞功能较低，粒细胞功能较低，NK细胞活性高。细胞活性高。BALB/c-nu的胸腺的胸腺昆明小鼠的胸腺昆明小鼠的胸腺 3、裸鼠的应用、裸鼠的应用裸鼠在肿瘤研究上的应用：裸鼠在肿瘤研究上的应用：制作人类肿瘤移植瘤模型制作人类肿瘤移植瘤模型人类肿瘤移植于动物
19、的历史人类肿瘤移植于动物的历史 免疫排斥问题免疫排斥问题 眼前房，脑内，地鼠的颊囊等免疫逃避部位眼前房，脑内，地鼠的颊囊等免疫逃避部位 免疫抑制剂、射线照射的使用免疫抑制剂、射线照射的使用 裸鼠作为人类肿瘤受体裸鼠作为人类肿瘤受体肿瘤移植瘤模型在肿瘤移植瘤模型在肿瘤基础研究肿瘤基础研究中的意义中的意义 添加人为因子（致突变剂，癌基因，药物等）观察肿瘤添加人为因子（致突变剂，癌基因，药物等）观察肿瘤 病因及机理和治疗。病因及机理和治疗。 建立肿瘤细胞株：提供大量肿瘤组织供分析。建立肿瘤细胞株：提供大量肿瘤组织供分析。 诊断和预后：建立平行模型，明确诊断和诊断和预后：建立平行模型，明确诊断和 跟踪
20、预后。跟踪预后。 个体化疗有效试验：对于晚期和复发肿瘤有重要意义。个体化疗有效试验：对于晚期和复发肿瘤有重要意义。 药物有效的标准：药物有效的标准：1.肿瘤不生长；肿瘤不生长；2.肿瘤生长缓慢；肿瘤生长缓慢；3.肿肿 瘤长出后又消失；瘤长出后又消失；4.肿瘤无转移；肿瘤无转移；5.动物寿命延长。动物寿命延长。肿瘤移植瘤模型制作方法肿瘤移植瘤模型制作方法 肿瘤组织块或肿瘤细胞皮下移植肿瘤组织块或肿瘤细胞皮下移植 腹腔内或肾包膜下移植腹腔内或肾包膜下移植 原位移植原位移植移植瘤模型成功制作的影响因素：移植瘤模型成功制作的影响因素： 肿瘤组织：肿瘤组织： 恶性程度：恶性和转移复发瘤成功率较高恶性程度
21、：恶性和转移复发瘤成功率较高 种类：细胞系成功率种类：细胞系成功率活检标本活检标本 来源：淋巴瘤、骨肿瘤等难获成功来源：淋巴瘤、骨肿瘤等难获成功 部位：肿瘤块的外周部接种易成活部位：肿瘤块的外周部接种易成活 裸鼠：裸鼠： 遗传背景：胰腺癌接种遗传背景：胰腺癌接种BALB/c 成功，成功，NIH系失败系失败 性别：雌激素依赖性肿瘤接种雄鼠生长慢性别：雌激素依赖性肿瘤接种雄鼠生长慢 鼠龄：鼠龄：4-6周周 动物健康状态动物健康状态 接种部位：接种部位：原位移植成功率高，移植肿瘤与人类原发原位移植成功率高，移植肿瘤与人类原发瘤相似。有些肿瘤需要接种在特定的部位（对雌激素瘤相似。有些肿瘤需要接种在特定
22、的部位（对雌激素依赖的人乳腺癌依赖的人乳腺癌MCF-7细胞系，接种乳腺脂肪垫才能细胞系，接种乳腺脂肪垫才能成活）。成活）。 其他：其他：环境：细菌病毒可以影响环境：细菌病毒可以影响NK细胞活性；接种时细胞活性；接种时间越早越好，注意无菌操作。间越早越好，注意无菌操作。（2）裸鼠在医学其他领域的应用：）裸鼠在医学其他领域的应用：免疫学：研究体液免疫与细胞免疫的关系，研究免疫免疫学：研究体液免疫与细胞免疫的关系，研究免疫相关疾病相关疾病寄生虫：寄生虫感染的动物模型，美洲锥虫，卡氏肺寄生虫：寄生虫感染的动物模型，美洲锥虫，卡氏肺囊虫囊虫皮肤：鱼鳞病皮肤：鱼鳞病免疫缺陷模型：麻风，结核免疫缺陷模型：麻
23、风，结核 （四）严重联合免疫缺陷小鼠（四）严重联合免疫缺陷小鼠 （Sever Combined Immunodeficient Mice, SCID mice）1983年年Bosma首次报告，来源于首次报告，来源于C.B-17小鼠。小鼠。由于第由于第16对染色体隐性基因突变，纯合突变导对染色体隐性基因突变，纯合突变导致淋巴细胞抗原受体基因致淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域重排的重组区域重排的重组酶活性异常，基因重排时断裂无法正常连接，酶活性异常，基因重排时断裂无法正常连接，从而影响从而影响B、T细胞的正常功能分化。细胞的正常功能分化。1988年我国医科院动物所从美国年我国医科院动物所从美国Jac
24、kson实验室实验室引进；引进；1992年我校从澳大利亚引进。年我校从澳大利亚引进。 1、生物学特点：、生物学特点：外观体重与普通小鼠相同。外观体重与普通小鼠相同。繁殖特点：纯合子兄妹交配。繁殖特点：纯合子兄妹交配。对鼠肝炎，巴氏杆菌、卡氏肺囊虫极易感染，感染后对鼠肝炎，巴氏杆菌、卡氏肺囊虫极易感染，感染后易发病死亡。必须养育在易发病死亡。必须养育在SPF环境中，平均寿命环境中，平均寿命1年以年以上。上。 2、组织解剖学特点：、组织解剖学特点：脾脏、胸腺、淋巴结体积低于普通小鼠的脾脏、胸腺、淋巴结体积低于普通小鼠的30%，淋巴，淋巴组织缺乏淋巴细胞。（胸腺残留上皮样细胞和成纤维组织缺乏淋巴细胞
25、。（胸腺残留上皮样细胞和成纤维细胞，脾脏没有脾小体，白髓缺限，红髓正常，淋巴细胞，脾脏没有脾小体，白髓缺限，红髓正常，淋巴结由网状细胞构成。）结由网状细胞构成。）外周血白细胞总数减少，淋巴细胞占外周血白细胞总数减少，淋巴细胞占1020%，非淋，非淋巴性造血细胞如粒细胞，巨噬细胞正常，巴性造血细胞如粒细胞，巨噬细胞正常，NK、LAK细胞正常。细胞正常。3、免疫功能特点：、免疫功能特点：没有没有B、T 阳性标志细胞，对外来抗原无细胞和体液免疫。阳性标志细胞，对外来抗原无细胞和体液免疫。NK、LAK细胞功能正常或增高；肥大细胞因缺乏细胞功能正常或增高；肥大细胞因缺乏T细胞因子细胞因子而分化受阻。而分
26、化受阻。约约2-23%的的SCID小鼠在青年期小鼠在青年期B、T细胞功能可以恢复，称为细胞功能可以恢复，称为渗漏（渗漏（Leaky），此时仍带有），此时仍带有SCID基因，淋巴细胞不受影响基因，淋巴细胞不受影响而发育成熟，原因不明，可以用血清学和组织学方法诊断。而发育成熟，原因不明，可以用血清学和组织学方法诊断。4、SCID小鼠的应用小鼠的应用用于自然防御细胞如用于自然防御细胞如NK、LAK、巨噬细胞、粒细胞，及免疫、巨噬细胞、粒细胞，及免疫辅助细胞的分化和功能研究，也可以研究这些细胞与输入的辅助细胞的分化和功能研究，也可以研究这些细胞与输入的B、T细胞、淋巴因子的相互作用。细胞、淋巴因子的相互作用。能接受人类造血组织的移植，是淋巴细胞分化功能的活体测能接受人类造血组织的移植，是淋巴细胞分化功能的活体测试系统，可以用于评价人各类淋巴细胞的抗肿瘤活性。试系统，可以用于评价人各类淋巴细胞的抗肿瘤活性。肿瘤接种成活率比裸鼠高。何杰金氏淋巴瘤，白血病模型肿瘤接种成活率比裸鼠高。何杰金氏淋巴瘤，白血病模型寄生虫：人血丝虫病寄生虫：人血丝虫病
