1、细胞凋亡及检测技术细胞凋亡及检测技术第一节第一节概概 述述一、细胞凋亡的概念一、细胞凋亡的概念细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis(apoptosis，这是，这是19721972年年KerrKerr等建等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。变化形式的。细胞在一定的生理或病理条件下，遵细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体脱落离体或裂解为若干凋亡小体(apoptotic (apoptotic bodiesbodies，而被
2、其他细胞吞噬。，而被其他细胞吞噬。“凋亡凋亡”一词来自一词来自希腊语，希腊语，apo意为意为“分离分离”，ptosis指花瓣或树叶指花瓣或树叶的脱落，的脱落，“凋亡凋亡”是由这两个词组合而成，意指细是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡的形态类似胞凋亡的形态类似秋天秋天花瓣或树叶的凋落一样。花瓣或树叶的凋落一样。二、研究简史二、研究简史半个世纪前半个世纪前: :人们就观察到在生物的发生、人们就观察到在生物的发生、生长、发育以及衰老过程中，一直伴随着组织生长、发育以及衰老过程中，一直伴随着组织细胞的生理自发退化死亡现象细胞的生理自发退化死亡现象. .19651965年年: :发育生物学家发育生物学家
3、LockshinLockshin和和WilliamsWilliams首先提出了首先提出了PCDPCD（程序化死亡）一词，用于描（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程，认为随着成年蛾的出现，其述蛾的发育过程，认为随着成年蛾的出现，其幼虫死亡是一种发育调节性死亡。幼虫死亡是一种发育调节性死亡。 1972 1972年年:Kerr:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概等首次提出了细胞凋亡的概念，从形态学角度描述细胞的生理死亡，并认念，从形态学角度描述细胞的生理死亡，并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象，可能具有十分重要的生物学意义。物学现象，可能具
4、有十分重要的生物学意义。19771977年年: :人们注意到在生理或病理性刺激人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。并条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象，可能具有十分重要的生物学意义。生物学现象，可能具有十分重要的生物学意义。 19801980年年:Wyllie:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和亡的共同形态学特征，包括核固缩和
5、DNADNA降解成降解成寡核苷酸片段等。寡核苷酸片段等。19891989年年: 0wen: 0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中，发现性选择过程中，发现T T细胞受体细胞受体(TCR)(TCR)与自身抗原与自身抗原相互作用与未成熟相互作用与未成熟T T细胞的细胞的PCDPCD发生有关，并在体发生有关，并在体外证实剌激外证实剌激CD3CD3分子可诱导未成熟分子可诱导未成熟T T细胞细胞PCDPCD的发的发生。证明了信号传递物质对生。证明了信号传递物质对PCDPCD的调控作用。的调控作用。 19911991年年:Ellis:Ellis首先发现了线虫首先发现了
6、线虫(C.elegans(C.elegans) )体内体内Ced-3Ced-3、4 4两个基因与两个基因与PCDPCD的发生密切相关，的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参与随后逐渐发现了多种参与PCDPCD的正相调节基因和的正相调节基因和负相调节基因，前者包括负相调节基因，前者包括Ced-2Ced-2、p53p53、cmyccmyc、FasFas、糖皮质激素受体及白细胞介素、糖皮质激素受体及白细胞介素11转化转化(ICE(ICE等基因，后者则有等基因，后者则有Ced-9Ced-9、bcl-2bcl-2、p53p53等等基因基因. .三、细胞凋亡的特征三、细胞凋亡的特征n细胞凋亡与细胞坏死虽然都
7、是细胞死亡，细胞凋亡与细胞坏死虽然都是细胞死亡，但细胞凋亡的形态及生化特征与坏死性但细胞凋亡的形态及生化特征与坏死性细胞死亡的特点则不同细胞死亡的特点则不同（一）细胞凋亡的形态学改变：（一）细胞凋亡的形态学改变： 组织内单个细胞或小团细胞的死亡组织内单个细胞或小团细胞的死亡 不引发细胞自溶，也不引起炎症反应不引发细胞自溶，也不引起炎症反应电镜下可见：凋亡细胞固缩电镜下可见：凋亡细胞固缩 胞浆致密，细胞器密集、退变胞浆致密，细胞器密集、退变 核染色质致密，聚集于核膜处核染色质致密，聚集于核膜处 胞核裂解，胞浆形成多发性芽突胞核裂解，胞浆形成多发性芽突 凋亡小体形成凋亡小体形成光镜下：凋亡小体外被
8、以胞膜，圆形或卵圆形，胞光镜下：凋亡小体外被以胞膜，圆形或卵圆形，胞浆浓缩，强嗜酸性，可有可无固缩深染的核碎片。浆浓缩，强嗜酸性，可有可无固缩深染的核碎片。细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死 单细胞丢失单细胞丢失细胞膜发泡但仍完整细胞膜发泡但仍完整,细胞膜内细胞膜内陷将细胞分割成凋亡小体陷将细胞分割成凋亡小体不发生炎症反应不发生炎症反应被临近正常细胞或吞噬细胞吞被临近正常细胞或吞噬细胞吞噬噬溶酶体完整溶酶体完整染色质均一凝集染色质均一凝集 细胞成群丢失细胞成群丢失细胞膜不完整细胞膜不完整,细胞细胞肿胀、溶解肿胀、溶解发生严重
9、炎症反应发生严重炎症反应被巨噬细胞吞噬被巨噬细胞吞噬溶酶体裂解溶酶体裂解染色质凝集成块、染色质凝集成块、不均一不均一 细胞坏死时核的变化细胞坏死时核的变化细胞坏死时的细胞坏死时的炎症反应炎症反应(二二)细胞凋亡的生化改变：凋亡过程中出现的生化细胞凋亡的生化改变：凋亡过程中出现的生化改变以改变以DNA的片段化及蛋白质的降解最为重要。的片段化及蛋白质的降解最为重要。1)DNA的片段化的片段化 组成染色质的组成染色质的DNA链被激活的核链被激活的核酸内切酶切割，可形成酸内切酶切割，可形成180200bp或其整倍数的或其整倍数的片段，电泳中呈特征灶的片段，电泳中呈特征灶的“梯梯”状条带状条带，这是判断
10、，这是判断凋亡发生的客凋亡发生的客 观指标之一。观指标之一。2)蛋白质的降解蛋白质的降解 凋亡蛋白酶激活，水解细胞的蛋白质结构，导致细凋亡蛋白酶激活，水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体并形成胞解体并形成凋亡小体凋亡小体、水解相关活性蛋白，从而、水解相关活性蛋白，从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别 细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死生理因素诱导生理因素诱导非生理因素造成的意非生理因素造成的意外损伤外损伤受大分子合成和激活过程的严受大分子合成和激活过程的严格调控格调控离子稳态调节丧失离子稳态
11、调节丧失需要能量需要能量不需要能量不需要能量需要大分子合成需要大分子合成不需要核酸和蛋白质不需要核酸和蛋白质的合成的合成有新基因从头转录有新基因从头转录没有新基因转录没有新基因转录染色质非随机降解为染色质非随机降解为DNA“梯带梯带” 染色质染色质DNA随机降随机降解解四、细胞凋亡的过程与调控四、细胞凋亡的过程与调控 凋亡信号转导凋亡信号转导凋亡基因激活凋亡基因激活细胞凋亡的执行细胞凋亡的执行凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除(一一)凋亡的四个阶段：凋亡的四个阶段： 凋亡诱导因素凋亡诱导因素+ 受体受体cAMPCa2+神经酰胺神经酰胺死亡信号死亡信号凋亡基因激活凋亡基因激活DNase激活激活Casp
12、ase激活激活巨噬细胞吞噬巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞分解凋亡细胞（二）细胞凋亡的调控（二）细胞凋亡的调控1 . 细胞凋亡的相关因素细胞凋亡的相关因素（1） 诱导性因素诱导性因素激素和生长因子失衡：缺乏（激素和生长因子失衡：缺乏（IL-2，淋巴细胞凋，淋巴细胞凋亡）或过多（糖皮质激素亡）或过多（糖皮质激素，淋巴细胞凋亡），淋巴细胞凋亡） 理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等药物等 免疫性因素：如，免疫性因素：如，CTL分泌粒酶分泌粒酶靶细胞凋亡靶细胞凋亡微生物因素：细菌、病毒及毒素。（微生物因素：细菌、病毒及毒素。（HIV） （2）抑制性因
13、素：）抑制性因素： 细胞因子：细胞因子：IL-2、神经营养因子、神经营养因子激素：激素：ACTH、睾丸酮、雌激素等、睾丸酮、雌激素等二价金属阳离子：二价金属阳离子：Zn2+药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨基酸氨基酸病毒：病毒：EB病毒、牛痘病毒病毒、牛痘病毒CrmA2 .细胞凋亡信号转导细胞凋亡信号转导凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。凋亡信号转导系统的特点：凋亡信号转导系统的特点：多样性：不同种类细胞有不同系统多
14、样性：不同种类细胞有不同系统耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节交、耦联，耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节交、耦联，同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统研究较多的系统：研究较多的系统：依据：依据：细胞凋亡时胞内游离细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升浓度显著上升用用Ca2+载体载体A23187人为升高人为升高B淋巴细胞淋巴细胞Ca2+水水平，平，B淋巴细胞凋亡淋巴细胞凋亡用用Ca
15、2+络合剂降低胞内络合剂降低胞内Ca2+水平，阻止细胞凋亡水平，阻止细胞凋亡 激活激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶依赖谷氨酰胺转移酶Ca2+ 活化核转录因子活化核转录因子1胞内胞内Ca2+信号系统（信号系统（Ca2+为第二信使）为第二信使）2cAMP/PKA信号系统（信号系统（cAMP为第二信使）为第二信使）依据：依据：双丁酰双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡细胞凋亡糖皮质激素使糖皮质激素使cAMP上升上升cAMP激活激活PKA使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝AA）残基磷酸化）残基磷酸化改变蛋白质功能改变蛋白质功能3Fas蛋
16、白蛋白/Fas配体信号系统配体信号系统Fas蛋白：细胞膜跨膜蛋白蛋白：细胞膜跨膜蛋白Fas蛋白蛋白+Fas配体（抗配体（抗Fas）细胞凋亡细胞凋亡机制：机制：Fas蛋白蛋白+Fas配体（抗配体（抗Fas）神经鞘磷脂酶活性神经鞘磷脂酶活性产生神酰胺产生神酰胺蛋白激酶激活蛋白激酶激活细胞凋亡细胞凋亡Fas蛋白蛋白+抗抗Fas、TNF 激活激活ICE样样caspase 降降解解H1组蛋白组蛋白染色体松驰染色体松驰DNA暴露内切酶位点暴露内切酶位点通过通过Ca2+信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡4神经酰胺信号系统神经酰胺信号系统神经酰胺：神经鞘磷脂（神经酰胺：神经鞘磷脂
17、（SM）在神经鞘磷脂酶的）在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。作用下产生的一类新型第二信使物质。介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理u937白血病细胞，诱导细胞凋亡白血病细胞，诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、TNF-、Fas抗原、糖皮质激素抗原、糖皮质激素 5二酰甘油二酰甘油/蛋白激酶蛋白激酶C（PKC）信号系统）信号系统二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催催化下产生的一种第二信使物质。化下产生的一种第二信使物质。依据：依据：活化的活化的PKC1可诱
18、导可诱导u937白血病细胞凋亡白血病细胞凋亡抑制抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡细胞凋亡PKC激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖皮质激素、皮质激素、T细胞受体激活、细胞受体激活、IL-2撤除）撤除）6酪氨酸蛋白激酶系统酪氨酸蛋白激酶系统生长因子或细胞因子生长因子或细胞因子激活酪氨酸蛋白激酶激活酪氨酸蛋白激酶靶靶蛋白酪氨酸磷酸化蛋白酪氨酸磷酸化Ras蛋白激活蛋白激活通过通过Raf-1、MAPKK、MAPK蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化细胞分化细胞分化生长因子或细胞因子撤除生长因子或细胞因子撤除不能激活酪氨酸
19、蛋白不能激活酪氨酸蛋白激酶系统激酶系统细胞凋亡细胞凋亡3.凋亡相关基因凋亡相关基因三类：三类：抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：Bcl-2、EIB、IAP促进凋亡基因：促进凋亡基因：P53、Bax、ICE双向调节基因：双向调节基因：c-myc、Bclx(B细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤/白血病白血病-2B cell lymphoma / leukemia-2基因的缩写) Bcl-2蛋白：蛋白：229个氨基酸（人）、个氨基酸（人）、236个氨基酸（小鼠）个氨基酸（小鼠）分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜作用：作用：Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细
20、高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡胞凋亡依据：依据：导入导入Bcl-2基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导的凋亡子所诱导的凋亡淋巴细胞有淋巴细胞有20%呈呈Bcl-2阳性时，预后不佳（耐受放射阳性时，预后不佳（耐受放射线、抗癌药物）线、抗癌药物）1.Bcl-2 直接的抗氧化作用直接的抗氧化作用 抑制线粒体释放促凋亡蛋白质（细胞色素抑制线粒体释放促凋亡蛋白质（细胞色素C、AIF） 抑制促凋亡性调节蛋白质抑制促凋亡性调节蛋白质Bax、Bak的细胞毒作用的细胞毒作用 抑制凋亡蛋白酶（抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活）的激活 维持细胞钙
21、稳态维持细胞钙稳态Bcl-2抗凋亡作用机制：抗凋亡作用机制：作用：作用：野生型（野生型（wtP53）：）：DNA结合蛋白，诱导细胞凋亡结合蛋白，诱导细胞凋亡（“分子警察分子警察”）突变型：抑制细胞凋亡突变型：抑制细胞凋亡野生型野生型P53的作用机制：的作用机制：P53蛋白蛋白细胞周期细胞周期G1期检期检查染色体查染色体DNA损伤（检查点功能）损伤（检查点功能）发现发现DNA损伤损伤剌激剌激CIP的表达的表达阻止细胞进入下一周期，启动阻止细胞进入下一周期，启动DNA修复机制修复机制修复失败修复失败启动细胞凋亡机制启动细胞凋亡机制细胞凋亡细胞凋亡2.P53c-myc: 一种癌基因，它能诱导增殖，也
22、能诱导细胞凋亡，具有一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双向调节作用。双向调节作用。作用机制：作用机制：c-myc蛋白为重要的转录调节因子，既可介蛋白为重要的转录调节因子，既可介导细胞增殖的基因，也可激活介导细胞凋亡的基因，其导细胞增殖的基因，也可激活介导细胞凋亡的基因，其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生长因子长因子增殖，无生长因子增殖，无生长因子凋亡）。凋亡）。Bcl-x：能翻译：能翻译Bcl-XL和和Bcl-Xs两种蛋白，两种蛋白，Bcl-XL蛋蛋白抑制细胞凋亡，白抑制细胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促进细胞凋亡（合成以
23、蛋白促进细胞凋亡（合成以谁为主）谁为主） 3.c-myc,Bcl-x五、五、 细胞凋亡的发生机制细胞凋亡的发生机制（一）氧化损伤（一）氧化损伤氧化损伤的后果之一：细胞凋亡氧化损伤的后果之一：细胞凋亡依据：依据：各种氧化剂（各种氧化剂（H2O2）可直接诱导细胞凋亡）可直接诱导细胞凋亡抑制超氧化物歧化酶（抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可诱导细胞凋亡）活性可诱导细胞凋亡抗氧化剂（抗氧化剂（VitE、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（景的各种凋亡诱导因素（TNF-、电离辐射）引起的细、电离辐射）引起的细胞凋亡胞凋亡引起引起DNA损伤，激活损伤，激活P
24、53基因基因引起引起DNA损伤，活化多聚损伤，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭核糖合成酶，耗竭NAD，消耗大量消耗大量ATP攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产生过氧羟基产生过氧羟基24碳四烯酸碳四烯酸激活激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶依赖的核酸内切酶细胞膜损伤，细胞膜损伤，Ca2+内流增多及损伤线粒体，通透性增内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜电位改变加膜电位改变活化核转录因子活化核转录因子NF-B、AP-1，加速凋亡相关基因表达，加速凋亡相关基因表达氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：（二）钙稳
25、态失衡（二）钙稳态失衡细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一依据：依据：各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程凋亡发生时胞浆凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后的浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）胞膜的空泡化）钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退行性疾病）退行性疾病）激活激活Ca2
26、+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解依赖的核酸内切酶，降解DNA链链激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成交联，有利于凋亡小体形成激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达Ca2+在在ATP的配合下使的配合下使DNA链舒展，暴露核小体链舒展，暴露核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割内切酶切割DNA钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：钙稳态失衡引起细胞凋亡的
27、可能机制：（三）线粒体损伤（三）线粒体损伤线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜电位（跨膜电位（m）下降，能量代谢水平显著降低）下降，能量代谢水平显著降低线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用依据：依据：抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡凋亡在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨膜电位（膜电位（m）下降）下降阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（Bcl-2
28、）线粒体改变引起细胞凋亡的机制：线粒体改变引起细胞凋亡的机制： CaCa2+2+NONO缺血缺血原卟啉原卟啉活性氧活性氧线 粒 体线 粒 体mm下下降降Bcl-2 (-)PTP开放开放Apaf+Cyt.CCaspase-9Caspase-9酶原酶原Caspase-9Caspase-9(+)Caspase-3Caspase-3酶原酶原Caspase-3Caspase-3(+)CaspaseCaspase抑制剂抑制剂AIF(-)蛋白质水解蛋白质水解细胞凋亡细胞凋亡DNA断裂断裂无活性核酸内切酶无活性核酸内切酶核酸内切酶激活核酸内切酶激活(+)(+)第二节第二节 细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法
29、 细胞凋亡检测方法：归纳起来，细胞凋亡检测方法：归纳起来，可分三方面，即根据凋亡的形态学特可分三方面，即根据凋亡的形态学特征、细胞凋亡的生化特征以及细胞凋征、细胞凋亡的生化特征以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。本节主要介绍亡的流式细胞仪检测。本节主要介绍细胞凋亡的常用病理学检测方法。细胞凋亡的常用病理学检测方法。一、苏木精一、苏木精- -伊红染色方法伊红染色方法(HE(HE染色染色) )1石蜡组织切片石蜡组织切片HE染色（略）染色（略）2细胞爬片或细胞涂片的细胞爬片或细胞涂片的HE染色染色（1）细胞爬片或细胞涂片的制备）细胞爬片或细胞涂片的制备： 贴壁生长细胞贴壁生长细胞(包括肿瘤细胞包括肿瘤细胞
30、)：让细胞：让细胞生长在盖玻片使其在上面爬行生长。取出生长在盖玻片使其在上面爬行生长。取出盖玻片，经盖玻片，经PBS轻轻漂洗后，用轻轻漂洗后，用4%的甲醛的甲醛或多聚甲醛在常温下固定或多聚甲醛在常温下固定510min，即可，即可染色。染色。 悬浮生长细胞悬浮生长细胞(包括肿瘤细胞包括肿瘤细胞)或贴壁生或贴壁生长的细胞经消化脱壁成单细胞悬液后，可长的细胞经消化脱壁成单细胞悬液后，可经细胞涂片后染色。经细胞涂片后染色。（2）染色方法）染色方法:同石蜡组织切片同石蜡组织切片HE染色，免染色，免去第去第1和第和第2步。步。 【结果判断】 1.光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡光学显微镜下细
31、胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，细胞在组织中单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等。核碎裂等。 2.在细胞爬片上，凋亡的细胞变圆、变小，可见细胞在细胞爬片上，凋亡的细胞变圆、变小，可见细胞核固缩、碎裂，染色体被染成深蓝色或蓝黑色；可见细核固缩、碎裂，染色体被染成深蓝色或蓝黑色；可见细胞膜皱折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小胞膜皱折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体体(apoptotic bodies。而正常细胞经染色后仍保持细。而正常细胞经染色后仍保持细胞原有的生长形状胞原有的生长形状(如梭形或多角形如梭形或多角形)，细
32、胞核规整，染成，细胞核规整，染成均一蓝色。细胞涂片时可见凋亡细胞核固缩、碎裂，染均一蓝色。细胞涂片时可见凋亡细胞核固缩、碎裂，染色变深；正常细胞染色体显均匀淡蓝色或蓝色，而坏死色变深；正常细胞染色体显均匀淡蓝色或蓝色，而坏死细胞细胞肿胀，可见细胞膜的连续性破坏，核染色体染细胞细胞肿胀，可见细胞膜的连续性破坏，核染色体染成很淡的蓝色甚至消失。成很淡的蓝色甚至消失。 嗜酸性小体嗜酸性小体(凋亡凋亡)嗜酸性变及嗜酸性小体嗜酸性变及嗜酸性小体肝细胞体积缩小，胞浆浓缩红染，呈嗜肝细胞体积缩小，胞浆浓缩红染，呈嗜酸性变；或胞浆进一步浓缩，细胞变圆，酸性变；或胞浆进一步浓缩，细胞变圆，核碎裂、溶解消失，呈嗜
33、酸性小体状核碎裂、溶解消失，呈嗜酸性小体状二、甲基绿二、甲基绿- -派诺宁染色法派诺宁染色法【染色原理【染色原理】 细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态，但两者发生机制不同。缩等细胞死亡形态，但两者发生机制不同。细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。而细胞坏死则是一种被动的细表达的增强。而细胞坏死则是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有胞死亡过程，细胞质内常有RNA的损失。根的损失。根据这一特点，可应用试剂甲基绿对据这一特
34、点，可应用试剂甲基绿对DNA染色染色的特异性和派诺宁对的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，使甲基的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。【试剂及配制【试剂及配制】1.组织固定液组织固定液 无水乙醇无水乙醇600ml 氯氯 仿仿300ml 冰乙酸冰乙酸100ml 2.甲基绿纯化甲基绿纯化 新购买的甲基绿新购买的甲基绿(methyl green)需用氯仿进行需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫。方法是将纯化处理以
35、去除甲基紫。方法是将2%甲基绿水甲基绿水溶液溶液20ml倾入洁净分液漏斗，加入氯仿倾入洁净分液漏斗，加入氯仿20ml充充分混匀，使其内的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红分混匀，使其内的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉带色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉带紫红色的氯仿移去，再加入新的氯仿紫红色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，如，如此反复更换氯仿，直到无紫红色为止。该液作此反复更换氯仿，直到无紫红色为止。该液作为贮存液，为贮存液，4保存。保存。3.染色液染色液甲基绿贮存液甲基绿贮存液5m15%派诺宁水溶液派诺宁水溶液lm1蒸馏水蒸馏水12m12mol/L乙酸钠乙酸钠(
36、pH4.8)18ml(临用前配临用前配制，滤纸过滤制，滤纸过滤) 【操作方法【操作方法】1.新鲜取材组织置组织固定液中新鲜取材组织置组织固定液中4固定固定36h；2.直接转入直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水，二乙醇脱水和无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋；甲苯透明，石蜡包埋；3.切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水；切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水；4.置染色液中室温下染片约置染色液中室温下染片约lh；5.取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液；取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液；6.插入丙酮中迅速分化；插入丙酮中迅速分化；7.转入丙酮二甲苯转入丙酮二甲苯(1:1)稍洗；稍洗；
37、8二甲苯透明二甲苯透明23次；次；9中性树胶封固中性树胶封固 【结果判断】 凋亡细胞：光学显微镜下凋亡细胞细凋亡细胞：光学显微镜下凋亡细胞细胞核固缩呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红胞核固缩呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染。观察时可用凋亡指数进行计数，紫色着染。观察时可用凋亡指数进行计数，即随机选择约即随机选择约1020个视野个视野(每张切片约每张切片约10002500个细胞，计数凋亡细胞百分个细胞，计数凋亡细胞百分率。率。细胞坏死：只有固缩细胞核呈绿色着染。细胞坏死：只有固缩细胞核呈绿色着染。 三、吖啶橙染色法三、吖啶橙染色法【染色原理【染色原理】吖啶橙的荧光随吖啶橙的荧光随pH而变，其正色为
38、绿色，而变，其正色为绿色，随随pH下降可变到橙红色。吖啶橙与下降可变到橙红色。吖啶橙与DNA和和RNA通过两个部位结合，连接碱基对和磷酸盐基团，通过两个部位结合，连接碱基对和磷酸盐基团，吖啶橙与碱基对结合，形成第一复合物。第二吖啶橙与碱基对结合，形成第一复合物。第二复合物在多核苷酸表面，由吖啶橙与磷酸盐基复合物在多核苷酸表面，由吖啶橙与磷酸盐基团连接而成。团连接而成。pH 6.0时，时，DNA结合染料的聚合结合染料的聚合加速，加速，pH低于低于3.8时，聚合受抑制，时，聚合受抑制，而而RNA在在pH 6.0和和3.8都能聚合而使颜色变红都能聚合而使颜色变红。 【试剂及配制【试剂及配制】 吖啶橙
39、贮存液吖啶橙贮存液:10mg:10mg吖啶橙溶解于吖啶橙溶解于100ml 100ml PBSPBS中，中，pH 4.8pH 4.86.06.0滤过，滤过，4 40 0C C避光保存避光保存【操作方法【操作方法】1.制备活细胞悬液，浓度约为制备活细胞悬液，浓度约为107/ml2.取取95l细胞悬液，加细胞悬液，加5l吖啶橙贮存液混匀吖啶橙贮存液混匀3.吸一滴混合液滴于洁净玻片上，直接用盖吸一滴混合液滴于洁净玻片上，直接用盖玻片封片玻片封片4.荧光显微镜选用激发滤荧光显微镜选用激发滤片片BG12，BV等，等，阻断滤片用阻断滤片用515nm或或SP3 【结果判断【结果判断】 正常细胞：在荧光显微镜下
40、，细胞核正常细胞：在荧光显微镜下，细胞核DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红色荧光为桔黄或桔红色荧光 凋亡细胞：细胞核或细胞质内可见致密浓凋亡细胞：细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片 坏死细胞：细胞质内黄绿色或桔黄色荧光坏死细胞：细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可减弱或消失均可减弱或消失 四、原位末端标记四、原位末端标记 原位末端标记（原位末端标记（ISEL)ISEL)是将渗入到凋亡细胞中的外源是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶末端脱氧核苷酸转移酶（性核苷酸在酶末端脱氧核苷酸
41、转移酶（TdTTdT）和）和DNADNA聚聚合合酶酶I I或或KIenowKIenow大片段的催化下与凋亡细胞因内源性核大片段的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断链相结合，再通过一酸酶的激活而产生的单股或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。通常有两种方法定的显示系统使之显示出来。通常有两种方法: :末端脱末端脱氧核苷酸转移酶介导的氧核苷酸转移酶介导的dUTPdUTP缺口末端标记缺口末端标记( (简称简称TUNEL)TUNEL)；DNADNA聚合酶聚合酶I I或或KlenowKlenow大片段介导的原位缺口平移大片段介导的原位缺口平移( (简称简称INST)I
42、NST)。在不考虑所使用的催化酶时，统称为原位末端标。在不考虑所使用的催化酶时，统称为原位末端标记。记。 TUNELTUNEL鉴定的原理基于细胞凋亡时产生鉴定的原理基于细胞凋亡时产生DNADNA断链，所介导的酶是断链，所介导的酶是TdTTdT，该酶能将外，该酶能将外源性的生物素或地高辛标记的源性的生物素或地高辛标记的dUTPdUTP无需无需DNADNA模板连接到凋亡细胞核的模板连接到凋亡细胞核的DNADNA断链的断链的3-3-羟基羟基(3-0H(3-0H末端，末端，DNADNA断链可是单股断链也可断链可是单股断链也可是双股断链，两种断链都有游离的是双股断链，两种断链都有游离的3-3-羟基羟基末
43、端，因此，末端，因此，TUNELTUNEL鉴定可以检测凋亡细胞鉴定可以检测凋亡细胞核中的单股和双股核中的单股和双股DNADNA断链。断链。【试剂准备和配制】1. 0.15mol/L 的的PBS: 0.15mol/L NaCl， 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液；2蛋白酶蛋白酶K 20g/ml， 0.15mol/L的的PBS配制；配制；3组织预处理液组织预处理液(2SSC溶液溶液):先配制先配制20SSC溶液作为储存液，用时溶液作为储存液，用时10倍稀释倍稀释(1SSC溶液含溶液含 0.3mol/L NaCl， 30mmol/L枸橡酸纳枸橡酸纳)；4内源酶阻断剂内源酶阻断剂:3%H2
44、02-甲醇溶液（或甲醇溶液（或PBS）5缓冲液缓冲液A(buffer A250mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L MgC12， 10mmol/L -巯基乙醇，巯基乙醇， 0.005% BSA，pH 7.56链卵白素标记的辣根过氧化物酶；链卵白素标记的辣根过氧化物酶；7DAB-H202显色液显色液:DAB用用0.1mol/L Tris-Cl(pH7.6)配成配成0.4%，分装一，分装一20避光保存；避光保存；8TdT缓冲液缓冲液(pH6.8) 二甲胂酸纳二甲胂酸纳(Na-Cacodylate 100mmol/L二琉基苏糖醇二琉基苏糖醇(dithiothrenol 0.1mmol/L
45、氯化钻氯化钻(C00) 5mmol/L9TdT反应液反应液在在 T d T 缓 冲 液 中 加 入缓 冲 液 中 加 入 T d T 酶酶 1 0 0 U / m l ， 0.001mmol/L biotin-11-dUTP【染色步骤】1.切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行；切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行；2.3%的的H202阻断内源性过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶30min；3.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；4.切片浸泡在切片浸泡在2SSC 80 20min；5.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；6.蛋白酶蛋白酶K消化消
46、化020min；7.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；8.TdT缓冲液孵育缓冲液孵育 10min9. TdT反应液反应液37孵育孵育 1h；10.切片浸泡在切片浸泡在2SSC溶液溶液10min，以终止反应；，以终止反应；11. 0.15mol/L的的PBS洗洗3次次5min；12. 链卵臼素标记的辣根过氧化物酶孵育链卵臼素标记的辣根过氧化物酶孵育30min（POD）；）；13. 0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；14.0.04%的的DAB显色显色510min，镜下控制时间；，镜下控制时间；15.苏木精对比染色苏木精对比染色10-30sec，常
47、规复水、透明，常规复水、透明和封固。和封固。 【结果判断】 凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，细凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，细胞核形态呈碎点状，不规整，大小不一致。胞核形态呈碎点状，不规整，大小不一致。而正常非凋亡细胞和阴性对照片核被苏木素而正常非凋亡细胞和阴性对照片核被苏木素复染呈蓝色，核相对较大，形态大小较为一复染呈蓝色，核相对较大，形态大小较为一致致第三节第三节 细胞凋亡的应用细胞凋亡的应用一细胞凋亡与机体发育一细胞凋亡与机体发育 细胞凋亡是多细胞动物生命活动过程中不可细胞凋亡是多细胞动物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是动物借以存活的需要，因而缺少的组成内容，是动物借以存活的需要，
48、因而贯穿于动物全部寿命周期中。无论是低等动物还贯穿于动物全部寿命周期中。无论是低等动物还是高等动物，都是如此。在哺乳动物胚胎发生、是高等动物，都是如此。在哺乳动物胚胎发生、发育和成熟过程中，构成组织的细胞生死交替，发育和成熟过程中，构成组织的细胞生死交替，细胞凋亡是保证个体发育成熟所必需的。细胞凋亡是保证个体发育成熟所必需的。 二细胞凋亡与机体稳态二细胞凋亡与机体稳态 组成机体的细胞不但需要不断地与环境进行组成机体的细胞不但需要不断地与环境进行物质、信息和能量的交换，而且这些细胞本身也物质、信息和能量的交换，而且这些细胞本身也处在不断的更新中。这种更新是以细胞数量上的处在不断的更新中。这种更新
49、是以细胞数量上的恒定为前提的，因此是一种动态平衡状态，显然，恒定为前提的，因此是一种动态平衡状态，显然，各种细胞数量上稳定，不但保证了机体各组织器各种细胞数量上稳定，不但保证了机体各组织器官具有形态学上的稳定性，同时也是机体生理功官具有形态学上的稳定性，同时也是机体生理功能或内环境稳定的必要条件。没有这种细胞生理能或内环境稳定的必要条件。没有这种细胞生理性死亡，细胞更新就不可能发生，因此，细胞产性死亡，细胞更新就不可能发生，因此，细胞产生与细胞凋亡之间的平衡是机体稳态的基本条件，生与细胞凋亡之间的平衡是机体稳态的基本条件，它们的平衡一旦破坏，就会导致疾病的产生它们的平衡一旦破坏，就会导致疾病的
50、产生 三、三、 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡不足（一）细胞凋亡不足1. 肿瘤肿瘤发生机制：目前认为：细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途发生机制：目前认为：细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径，结径，凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径，结果导致病变组织内肿瘤细胞存活延长，存活大于死亡，肿果导致病变组织内肿瘤细胞存活延长，存活大于死亡，肿瘤细胞数目净增长加大，形成新生物。瘤细胞数目净增长加大，形成新生物。凋亡受抑的依据：凋亡受抑的依据：多种肿瘤组织中多种肿瘤组织中Bcl-2表达显著高于周围组织表达显著高于周围组织许多肿瘤许多肿瘤P53发生突
